[发明专利]一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因SNP位点的检测系统与应用

说明书

本发明提供了一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测系统与应用。本发明的检测系统含有6个工作单元，分别是(1)PCR反应单元、(2)PCR产物碱性磷酸酶处理单元、(3)单碱基延伸反应单元、(4)纯化单元、(5)芯片点样单元、(6)质谱检测及数据输出单元。本发明的PCR反应单元含有23对特异性引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑46所示。该23对特异性引物可检测与癫痫用药相关10个基因的23种变异位点。本发明还提供了上述检测系统在检测癫痫用药相关基因并指导用药中的应用，检测结果准确、针对性强、灵敏度高、特异性强，简便快速，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及PCR检测技术和质谱检测技术领域，特别是涉及一种基于飞行质谱平台的用于检测癫痫用药相关基因的检测系统及其应用。

背景技术

癫痫是常见的慢性神经系统脑部疾患。其发病机制目前尚未完全阐明。一般认为，兴奋性和抑制性神经传递的失调是导致癫痫发作的主要原因。目前，世界上约有5000多万人患有癫痫病，我国有900万人左右患有此病。癫痫发病率是指每年每10万人口中新发现的癫痫病人数。世界上每年会出现150万癫痫新病人，我国每年也有近30万人患此病。研究表明，癫痫具有遗传性。不同的患者即使具有相同的临床症状，药物的治疗结果也可能因人而异。这种治疗结果的不同可能至少部分由遗传因素引起。原发性癫痫的遗传有的是单基因遗传，多数情况下是多基因遗传，但不一定都有临床发作。

目前，对于癫痫的发作主要采用抗癫痫药物(anti-epileptic drugs,AEDs)来控制，药物治疗的机制主要是使兴奋性和抑制性神经传递恢复平衡。AEDs的治疗往往为一个长期过程，有的甚至伴随患者的终生。

对于患有癫痫的个体而言，关键的问题在于，发作是否能够得到完全控制，AEDs的最佳剂量是什么，是否会有严重的不良反应发生。在癫痫的治疗过程中，临床发现AEDs的代谢存在较大的个体差异，不同个体所用的药物剂量相差4倍，即使患者发作类型相同，应用相同剂量的同种AEDs治疗，其血药浓度与疗效也相差甚远，有的患者用到最大耐受剂量时，仍不能控制发作，而有的患者应用常规剂量，就会出现严重的药物副作用。同一种癫痫综合征，用相同的AEDs进行治疗，治疗效果和预后也可能完全不同。多种因素导致了这些差异，而这种差异是无法预测的。因此对于AEDs而言，个体化给药显得尤为重要。

遗传因素无疑是所有影响因素中的一个重要部分，药物基因组学为个体化给药的研究提供了一个新的手段，以药物效应及安全性为目标，研究各种基因突变与药效及安全性的关系。单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是DNA序列上发生的单个核苷酸碱基之间的变异，在人群中这种变异的发生频率至少大于1％，否则被认为是点突变。人类遗传基因的各种差异，有90％都可归因于SNP所引起的基因变异。药物基因组学的终极目标是用个体基因层面的差异来预测药物的反应和有效性。

飞行质谱技术是一种先进的基因分析工具，通过引物延伸反应与灵敏、可靠的基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术相结合，实现基因分型检测。根据应用需要，对于数十到数百个SNP位点进行数百至数千份样本检测时，具有最佳性价比。特别适合于有限数量的研究位点已经确定的情况。

该技术是通过聚合酶链式反应(PCR)扩增出含有待测SNP位点的目的DNA片段，然后用虾碱性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)去除PCR体系中剩余的脱氧核糖核酸三磷酸(dNTP)和引物，再加入单碱基延伸引物，其3‘末端碱基紧挨SNP位点，且与目的片段上的碱基完全互补，采用四种ddNTP替代dNTP，这样，探针在SNP位点处仅延伸一个碱基，连接上的ddNTP与SNP位点的等位基因对应。用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)检测延伸产物与未延伸引物间的分子量差异，确定该点处碱基。目前没有基于飞行质谱技术来检测癫痫用药相关基因突变的报道。

发明内容