[发明专利]一种小RNA高通量测序检测微生物的方法

说明书

本发明涉及一种新的通过RNA捕获‑小RNA高通量测序(RNA capture and sRNA‑seq，RC&sRNA‑seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。该方法可以一次性检测样品中几千种微生物，并可以达到极高的灵敏度。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体提出了一种基于小RNA高通量测序(small RNAsequencing，sRNA-seq)检测病毒、细菌和真菌等微生物的方法。根据本发明的方法可以一次性检测样本中几千种微生物，并可以达到极高的灵敏度。这种方法由南开大学高山和中国农科院陈泽等在国际上首次提出，并命名为RNA捕获-小RNA高通量测序(RNA captureand sRNA-seq，RC&sRNA-seq)。

背景技术

基于高通量测序检测微生物的方法具有灵敏度高、覆盖种类多和能够检测新病毒等优势，已成为微生物检测领域的一类重要方法。小RNA(small RNA，sRNA)是长度在200nt以下的RNA分子的总称，小RNA高通量测序是高通量测序的一种。2013年，南开大学高山等在国际微生物大会(WCM 2013)上首次提出小RNA高通量测序可以用于临床病毒检测，并通过大数据挖掘检测到六类严重危害人类健康的病毒，分别是人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)和EB病毒(EBV)。但是，由于哺乳动物(特别是人类等高级哺乳动物)生命系统的复杂性，常规的小RNA高通量测序检测的信噪比(病毒序列与宿主序列比例)一直难以提高。直到2016年，南开大学高山和中国农科院陈泽等通过开发新的RNA捕获-小RNA高通量测序的方法，将病毒检测信噪比大大提高，并推广到可以检测细菌和真菌，为这一方法的广泛应用奠定了基础。

发明内容

本发明提供了一种通过RNA捕获-小RNA测序(RNA capture and sRNA-seq，RC&sRNA-seq)检测微生物的方法。所述方法包括以下步骤：

(1)提取生物样品中的总RNA，通过酶切或物理打断得到片段化的RNA；

(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物(如生物素Biotin)的DNA探针进行杂交，得到经标记的RNA-DNA杂交产物；

(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA-DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体(如链霉亲和素Streptavidin，SAV)的磁珠混合，使磁珠吸附所述经标记的RNA-DNA杂交产物，洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物；

(4)加热使磁珠上的RNA-DNA杂交产物变性，洗脱回收RNA，向回收物中加入DNA酶降解DNA片段；

(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端，得到带有3′端接头的RNA；

(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交，得到RNA-引物杂交产物；

(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA-引物杂交产物的RNA的5′端，得到带5′端接头的RNA-引物杂交产物；

(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA-引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR，得到扩增的cDNA片段，选择长度在130-200bp范围内的cDNA片段进行测序，测序长度在50bp以上；

(9)去除步骤(8)中测序获得的序列(即原始读段)3′端的测序接头，再去除15bp长度以下的序列，得到清理后的序列；