[发明专利]一种小RNA高通量测序检测微生物的方法

权利要求书

1.一种通过RNA捕获-小RNA测序检测微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取生物样品中的总RNA，通过酶切或物理打断得到片段化的RNA；

(2)将步骤(1)中所述片段化的RNA与带有标记物的DNA探针进行杂交，得到经标记的RNA-DNA杂交产物；

(3)将步骤(2)中所述经标记的RNA-DNA杂交产物与表面带有与所述标记物特异性结合的配体的磁珠混合，使磁珠吸附所述经标记的RNA-DNA杂交产物，洗脱除去未杂交的DNA探针与污染物；

(4)加热使磁珠上的RNA-DNA杂交产物变性，洗脱回收RNA，向回收物中加入DNA酶降解DNA片段；

(5)将接头连接到步骤(4)中回收的RNA的3′端，得到带有3′端接头的RNA；

(6)将步骤(5)中所述带有3′端接头的RNA与反转录引物退火杂交，得到RNA-引物杂交产物；

(7)将5′端接头连接到步骤(6)得到的所述RNA-引物杂交产物的RNA的5′端，得到带5′端接头的RNA-引物杂交产物；

(8)以步骤(7)中所述带5′端接头的RNA-引物杂交产物中RNA片段为模板进行反转录PCR，得到扩增的cDNA片段，选择长度在130-200bp范围内的cDNA片段进行测序，测序长度在50bp以上；

(9)去除步骤(8)中测序获得的序列3′端的测序接头，再去除15bp长度以下的序列，得到清理后的序列；

(10)使用bowtie或BWA软件，将清理后的序列与目标微生物基因组序列进行比对，将与所述目标微生物基因组序列的比对区域相比存在至多1个碱基不同的所述清理后的序列确定为目标小RNA序列；对目标小RNA序列进行计数，将5′端或3′端比对到所述目标微生物基因组序列中相同位置的所有目标小RNA序列计数为一次；如果样品中目标小RNA序列计数值超过指定阈值，则将该样品中该目标微生物的检测结果确定为阳性。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述微生物包括病毒、细菌和真菌；优选地，所述病毒包括人乳头状瘤病毒(HPV)、乙肝病毒(HBV)、丙肝病毒(HCV)、艾滋病病毒(HIV)、松鼠猴病毒(SMRV)、EB病毒(EBV)和严重急性呼吸道综合症冠状病毒(SARS-CoV)；优选地，所述细菌为布鲁氏菌；优选地，所述真菌为烟曲霉菌。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述生物样品为来源于动物(例如人)的血液、唾液、尿液、粪便、各种组织和/或细胞系；更优选地，为血液或患病组织。

4.根据权利要求1所述的方法，其中所述标记物为生物素，所述配体为链霉亲和素。

5.根据权利要求1所述的方法，其中所述DNA探针的序列为来自病毒、细菌或真菌基因的特异序列；优选地，所述特异序列的长度范围为21到50个核苷酸。。

6.根据权利要求1所述的方法，其中当所述目标微生物为病毒时，其指定阈值为100；当所述目标微生物为细菌和真菌时，其指定阈值为100。