[发明专利]一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法

说明书

一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，包括以下步骤：将外源基因导入到农杆菌中，并制成转化菌液；将受体材料浸泡到转化菌液中，再将受体材料置于共培养培养基中，培养得到侵染受体材料；将侵染受体材料置于RITA的选择培养基中，同时进行抗性筛选和再生；待苗高为0.5‑1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；将生根的植株移栽，得到转基因植株。本发明采用侵染受体广，植物叶片，愈伤组织，胚性细胞等均可为材料，通过农杆菌介导将外源基因导入植物细胞，直接通过浸没培养获得转基因植株，适合大规模的转基因批量生产。

技术领域

本发明属于植物组织培养领域，涉及一种高通量快速获得转基因植物的方法，特别涉及一种农杆菌介导结合浸没式培养快速获得转基因植物的方法。

背景技术

快速简便的转化方法是植物转基因研究领域的重要内容，是开展大规模基因功能研究和开发转基因植物新品种的有效技术手段。一直以来，植物转基因技术不断改进，转基因技术也日趋完善。随着转基因植物的种植面积和效益逐年增加，对转基因作物品种的需求也日益增大，导致对转基因技术的效率也越来越高，高效快速的转基因技术体系是缓解当前对转化要求的有效手段。

转基因技术可以现有品种品种进行定向改良，特别是在提高甘蔗的抗虫，抗除草剂能力上有着广泛对应用前景。但是，甘蔗转基因技术和其它植物相比，相对落后，直到上世纪九十年代才有成功的报道，但是大量获得甘蔗转基因的研究较少。采用浸没式培养的方法通过农杆菌介导转化可以实现大规模高通量的转化，获得大量转化植株，满足研究和生产的需求。解决当前传统的转化方法费时费力，同时受到再生体系建立困难的限制。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种通过浸没式培养快速获得转基因植物的方法。该方法是直接以胚性细胞或植物叶片为转基因受体，通过农杆菌介导，在培养瓶中完成抗性筛选和再生过程，快速获得转基因甘蔗的方法。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，包括以下步骤：

(1)将外源基因导入到农杆菌中，得到含有外源基因的农杆菌；将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，将菌体重悬于含100～120μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液；

(2)侵染

将受体材料置于(1)制备的转化菌液中浸泡培养后，将受体材料表面的液体吸干；再将受体材料置于共培养培养基中，于25±2℃暗培养3-4天，得到侵染受体材料；

所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L 2,4-D、2～2.5mg/L 6-BA、100～120μmol/LAS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至5.5～6.0；或者，所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L 6-BA、100～120μmol/LAS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至pH 5.5；

(3)通过间歇浸没培养进行分化与抗性筛选

将侵染受体材料置于气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器的培养容器中，在所述RITA反应器的营养液储存容器加入选择培养基，同时进行抗性筛选和再生，

所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加1～1.5mg/L 2,4-D、3～3.5mg/L 6-BA、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/LAmp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；