[发明专利]一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法

权利要求书

1.一种农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将外源基因导入到农杆菌中，得到含有外源基因的农杆菌；将含有外源基因的农杆菌培养至对数生长期，收集菌体，将菌体重悬于含100～120μmol/L乙酰丁香酮的MS液体培养基中，得到转化菌液；

(2)侵染

将受体材料置于(1)制备的转化菌液中浸泡培养后，将受体材料表面的液体吸干；再将受体材料置于共培养培养基中，于25±2℃暗培养3-4天，得到侵染受体材料；

所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L 2,4-D、2～2.5mg/L 6-BA、100～120μmol/L AS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至5.5～6.0；或者，所述共培养培养基为在MS培养基基础上，添加2～2.5mg/L 6-BA、100～120μmol/L AS和5.5～6.0g/L琼脂粉，再调节pH至pH 5.5～6.0；

(3)通过间歇浸没培养进行分化与抗性筛选

将侵染受体材料置于气泵驱动RITA间歇浸没式生物反应器的培养容器中，在所述RITA反应器的营养液储存容器加入选择培养基，同时进行抗性筛选和再生，

所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加1～1.5mg/L 2,4-D、3～3.5mg/L 6-BA、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，所述选择培养基是在MS液体培养基的基础上，添加3～3.5mg/L6-BA、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；

(4)待苗高为0.5-1cm时，将苗转移至改良MS培养基中进行生根诱导，得到生根的植株；

改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L 3-吲哚丁酸、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；或者，改良MS培养基是在MS培养基的基础上，添加1～1.5mg/L萘乙酸、0.5～1.0mg/L 3-吲哚丁酸、500～600mg/L Amp以及包括抗生素和除草剂的植物激素和与载体抗性标记相应的筛选物质，再调节pH至5.8～6.0；

(5)将生根的植株移栽，得到转基因植株。

2.如权利要求1所述的农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的外源基因为：膦丝菌素乙酰转移酶基因Bar。

3.如权利要求1所述的农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，步骤(1)中所述的将含有外源基因的农杆菌培养得到转化菌液的方法为：

将含有外源基因的农杆菌接种于YEB液体培养基中，于28℃摇床过夜，得到第一菌液；

再按体积百分比1％接种量将第一菌液转接入新的一份YEB液体培养基中培养至OD600为0.4～0.6，得到第二菌液；

将第二菌液在4℃、6000～7000rpm的条件下离心收集菌体；

将菌体转移至含100μmol/L AS的MS液体培养基中重新悬浮沉淀，培养至OD600为0.4～0.6，得到第三菌液；

将第三菌液转入含100μmol/L AS的MS液体培养基中，28℃摇床上培养至OD600到0.4～0.7。

4.如权利要求3所述的农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，所述YEB液体培养基中含有抗生素。

5.如权利要求1所述的农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，步骤(2)中所述浸泡培养的时间为20～35min。

6.如权利要求1所述的农杆菌介导结合浸没式培养获得转基因植物的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的受体材料为厚度为0.3～0.5cm的无菌植物叶片愈伤组织或胚性细胞。