[发明专利]一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法

说明书

本发明属于果树病毒检测技术领域，具体涉及一种Small‑RNA高通量测序技术快速准确诊断甜樱桃病毒的方法。采用以下步骤：从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E‑value≤1e‑50为标准，得到初选序列库，去除同源性≥97%的序列即为甜樱桃病毒数据库；提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small‑RNA深度测序；获得small RNA测序序列；处理后的序列进行组装；组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。本发明测序技术对甜樱桃树体内的病毒病样本进行快速、准确的诊断，弥补了常规病毒检测方法的不足，实际指导了甜樱桃病毒病的防控。

技术领域

本发明属于果树病毒检测技术领域，具体涉及一种Small-RNA高通量测序技 术快速准确诊断甜樱桃病毒的方法。

背景技术

高通量测序技术现已广泛应用于真核生物、原核生物、病毒等的基因组、转 录组、基因表达调控研究，具体的分析技术包括：1.De novo重头测序，2.DNA 重测序，3.RNA转录组、表达谱测序，4.MicroRNA发现及分析，5.甲基化测序， 6.DNA-蛋白质互作研究，7.目的区域捕获测序，8.外显子测序。

甜樱桃因其果实早熟、酸甜可口，而深受大众喜爱，种植效益高，成为近年 来发展较快的果树树种之一。但是甜樱桃为无性繁殖，新品种的推广和苗木繁育 主要通过嫁接进行，长期的无性繁殖使得甜樱桃品种和砧木树体内的病毒数量不 断增加，病毒病的危害越来越严重，对我国的甜樱桃产业的发展造成了重大危害。 据报道全世界能够危害甜樱桃的病毒种类高达40余种，我国发现10余种。因此， 亟需一种快速、准确判定甜樱桃树体内病毒情况的方法。目前常用的甜樱桃树体 病毒检测方法有物理学方法(电镜法)、血清学方法(酶联免疫ELISA)和聚合 酶链式反应(PCR)法，但这些方法的使用范围是有限的，如物理学方法需要利用 电子显微镜技术来判断是否有病毒以及病毒种类，这种方法需要专门的操作人员 熟练使用电子显微镜，而且材料处理繁琐、耗时、难度大；血清学需要病毒在甜 樱桃树体内得以表达并翻译成蛋白质，这种方法需要提前预知树体内的病毒种 类，获得病毒的蛋白质序列，而且血清学检测结果灵敏度低、准确性差；近年来 大家常用的PCR法必须基于已知病毒的核苷酸序列才能进行，检测病毒的范围 比较固定，难于发现新病毒，而且病毒在植物体内转录表达才能被检测到，受植 物细胞活性影响很大，如秋季的叶片和冬季的芽中几乎检测不到病毒的表达。总 的来说，在对未知病原物缺乏了解的情况下，这些检测方法就无法应用。因此， 检测已知或未知的甜樱桃病毒需要一个更为有效的方法来筛选疑似感染病毒的 样品。

发明内容

本发明采用Small-RNA测序技术对甜樱桃树体内的病毒病样本进行快速、准确 的诊断，弥补了常规病毒检测方法的不足，实际指导了甜樱桃病毒病的防控。 为实现上述目的，本发明采用以下方案：

一种Small-RNA高通量测序技术检测甜樱桃病毒的方法，采用以下步骤：

(1)从NCBI搜索所有植物病毒序列信息，以E-value≤1e-50为标准，得到初 选序列库，去除初选序列库中同源性≥97％的序列即为甜樱桃病毒数据库；

(2)提取甜樱桃叶片中的总RNA，构建小RNA测序文库，并进行Small-RNA 深度测序；

(3)获得small RNA测序序列；

(4)步骤(3)处理后的序列进行组装，对于组装出的大于100bp的重叠群寻找 高度同源序列：首先，用blastn将组装的重叠群比对到病毒核酸数据库中，选 出每一条序列的比对结果中e值最小的结果，再筛选出比对序列的同源性达到 90％的结果；设定如下比对参数：比对长度大于16nt，2个错配碱基以内，e＝0.01；

(5)将步骤(4)组装出来的序列进行拼接，得到病毒的相关序列。

优选地，步骤(2)所述的提取甜樱桃叶片中的总RNA的方法为：利用多糖多酚 植物总RNA提取试剂盒，提取甜樱桃叶片中总RNA。