[发明专利]基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B12的方法

权利要求书

1.一种基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B₁₂的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将维生素B₁₂生产菌株的种子进行培养活化，然后将活化后的维生素B₁₂生产菌株接种5%至SLB培养基中扩培后置于4℃温度下待用；

步骤二、采用过滤冷灭菌方法对木糖母液先进行预处理；

步骤三、将步骤一中扩培得到的维生素B₁₂生产菌株进行离心处理，弃上清液得到生产维生素B₁₂的沉淀菌株，将该沉淀菌株进行洗涤；

步骤四、将洗涤后的生产维生素B₁₂的沉淀菌株接种至含有步骤二预处理后的木糖母液为培养基原料的维生素B₁₂检测培养基中，与木糖母液一起进行发酵处理，同时将该维生素B₁₂检测培养基静置于黑暗环境中65h~80h，而且，在距离维生素B₁₂检测培养基10~50cm处设置光源，所述光源对维生素B₁₂检测培养基进行间歇性照射，光源每次光照时间持续10min~80min，其光照时间与黑暗时间的比例为1:2~5:1；

步骤五、将步骤四发酵处理后的发酵溶液进行细胞破碎处理，再将细胞破碎处理后的发酵液进行低温离心处理，离心后得到含维生素B₁₂的上清液，向该上清液中加入稀氰化钠溶液，再将处理后的上清液通过SPE柱萃取方式萃取维生素B₁₂，收集萃取后含有维生素B₁₂的洗脱液，用氮气吹干，洗脱液干燥后的产物即为维生素B₁₂；

在步骤一中，所述维生素B₁₂生产菌株的种子为费氏丙酸杆菌或谢氏丙酸杆菌，将维生素B₁₂生产菌株的种子进行培养活化是指：将维生素B₁₂生产菌株的种子从保藏管中接种1%至500mL MRS液体培养基中，置于培养箱中厌氧培养10h~14h，其中，所述MRS液体培养基的成分包括，单位为g/L：蛋白胨10.0，牛肉浸粉5.0，酵母浸粉4.0，葡萄糖20.0，磷酸氢二钾2.0，乙酸钠5.0，柠檬酸三铵2.0，硫酸镁0.2，硫酸锰0.05，吐温-80 1.0，pH 为6.5±0.2；

在步骤一中，扩培方式是将维生素B₁₂生产菌株置于SLB培养基中，在培养箱中静置培养2h~9h，使培养基中菌落形成单位达10⁸CFU/mL，其中，SLB培养基成分包括，重量比：1%胰蛋白胨，1%酵母提取物，1.5%葡萄糖，0.25‰K₂HPO₄，0.05‰MnSO₄，0.1%吐温-80，调节pH 6.5±0.2；

在步骤四中，所述维生素B₁₂检测培养基的成分包括，单位为g/L：酸水解酪蛋白12.0，核黄素0.002，吐温-80 2.0，磷酸氢二钾1.0，磷酸二氢钾1.0，硫酸镁0.4，硫酸亚铁0.02，硫酸锰0.02，重量比1%的木糖母液，pH为6.3±0.2；

在步骤五中，所述SPE柱萃取方式的步骤包括：用5mL 90%的甲醇活化SPE柱子，再用15mL超纯水分三次洗涤甲醇，平衡柱子，处理后的上清液流过SPE柱后，先用5mL超纯水洗涤SPE柱吸附的杂质，再用真空泵抽干液体，然后用甲醇洗涤SPE柱，收集洗脱液留待后续处理。

2.如权利要求1所述的基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B₁₂的方法，其特征在于，在步骤二中，所述过滤冷灭菌方法使用的工具包括：注射器、过滤器和0.22μm滤膜，过滤冷灭菌方法的操作步骤包括：将过滤器加上滤膜后盖紧，将组装好滤膜的过滤器与注射器旋紧，将待灭菌的木糖母液装入注射器中，然后缓慢推动注射器，使注射器里的木糖母液从过滤器中流过后灭菌。

3.如权利要求1所述的基于光照调控的木糖母液微生物发酵维生素B₁₂的方法，其特征在于，在步骤三中，离心处理的条件是在4℃、3000r/min下离心10min，洗涤该沉淀菌株的方式是用0.9%氯化钠溶液将沉淀菌株反复洗涤三遍。