[发明专利]一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法，具体步骤如下：剪取3‑5周的拟南芥叶片用无弹性的纸质胶带或布质胶带固定叶片的上表皮和下表皮；轻轻撕掉叶片下表皮的无弹性的纸质胶带或布质胶带，将剪好的叶片放入含有酶解液的培养皿中；将放有叶片的培养皿置于摇床中培养30‑90min或者直至绝大部分或全部原生质体从叶片上脱离下来为止；将含有原生质体的酶解液转移到圆底离心管中，离心收集原生质体；用预冷的W5溶液清洗原生质体，用W5溶液重悬原生质体并在冰上放置最少30分钟。本发明将原生质体置于黑暗条件下培养，有效解决了光照培养引起的细胞死亡和凝聚现象，能极大的提高转化效率。

技术领域

本发明属于细胞生物技术领域，具体涉及一种拟南芥叶肉细胞原生质体及其制备方法和应用。

背景技术

植物原生质体是指去掉细胞壁但仍然保持活力的细胞团。由于缺少细胞壁的保护和支撑作用，原生质体可以吸收微生物、细胞器和核酸等大分子物质，这使它成为一种基础理论研究中重要的多用途细胞体系，在植物病毒、植物生理和作物育种研究上都有应用。从不同组织和植株分离的原生质体保留了原来的生理活性和调节功能，代谢方式和生理环境更接近细胞在整株植株上的状态，提供了比细菌、酵母菌、昆虫和哺乳类动物细胞更好的细胞体系用于植物研究，是细胞壁再生、细胞分化与分裂、胚胎形成、细胞器摄入、病毒侵染、生物与非生物胁迫、信号转导、细胞膜透性及离子转运、蛋白亚细胞定位、基因功能验证等研究的良好材料，随着基因组、蛋白组和代谢组学的发展，原生质体在基础研究上的用途还在不断扩展。

原生质体的制备效率受植物类型、器官差异、材料的预处理与否及处理方式、材料的年龄、酶解温度、震荡的方式和强度、渗透压调节物质的种类和浓度、离子的类型和PH等的影响。目前，拟南芥和烟草叶片原生质体的制备方法比较成熟，禾本科植物的原生质体制备方法相对滞后但是也日趋完善。制备原生质体的材料一般选取代谢活跃的组织或器官，如幼茎、叶鞘、叶片、根尖、根毛、子叶、胚轴、茎尖、愈伤组织、体细胞胚等。最近，Chen等又建立了玉米珠心原生质体的制备和转化体系，并将珠心原生质体用于细胞程序性死亡的研究。

目前，拟南芥叶肉细胞原生质体应用最广泛，其主要用于蛋白质亚细胞定位、蛋白活性检测、蛋白互作、基因调节，光信号转导等研究中。拟南芥叶肉细胞原生质体之所以能广泛应用的原因有：1）相对其他器官，叶片产量丰富；2）与未分化的悬浮细胞原生质体相比，叶肉细胞原生质体保留了大部分叶部细胞的特点；3）植株生长和原生质体短期培养不需要无菌的环境；4）不需要培养悬浮细胞等耗时的操作。

传统拟南芥叶肉细胞原生质体的制备方法相对比较成熟，但是也有一定缺陷。例如：1）原生质体的制备效率和转化效率受植株生长环境的影响，所以要严格控制植株的生长环境。短日照和弱光环境能提高原生质体的制备和转化效率；2）原生质体的制备过程需要将拟南芥叶片切成0.5-2mm的条状，切口处的细胞很容易被破坏，且在细胞壁酶解过程中需要真空处理，进一步加大了对细胞的机械损伤；3）需要4-5个小时才能得到可供转化的原生质体，耗时长。为此，Wu等人改进了传统的拟南芥原生质体制备方法，用Tape-Arabidopsis Sandwich 方法（在此称为“胶带法”）极大的提高了拟南芥叶肉细胞原生质体的制备效率。但是胶带法制备及转化原生质体在实验耗材的准备、原生质体制备的时间、转化过程都可以进一步优化和改进，特别是Wu等人的方法存在光照培养条件容易造成细胞体死亡和凝聚，原生质体转化操作很难大批量操作等缺陷。

传统的拟南芥原生质体制备方法对拟南芥材料的生长环境、植株年龄、生理状态有较高的要求，制备过程要对叶片进行切割和真空处理，对叶肉细胞造成很大的物理伤害，整个过程需要4-6个小时。Wu等人发明了一种新的方法-胶带法制备拟南芥叶肉细胞原生质体，该方法不受植株年龄、生长环境、生理状态等的限制，同时新的方法不需要对叶片进行切割和真空处理，减少了叶肉细胞的机械损伤，细胞组织碎片少，省去了酶解后对细胞进行过滤的步骤。更重要的是胶带法可以在1个小时之内完成原生质体的制备，与传统方法4-6个小时相比，极大地节省了实验时间。但是Wu等人的原生质体制备及转化方法也存在着缺陷，如原生质体在光照培养培养条件容易死亡和凝聚，转化效率低以及难大批量操作等。