[发明专利]一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)纳米粒的制备方法

说明书

本发明为一种叶酸‑壳聚糖‑表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)纳米粒的制备方法，属于食品生物技术领域。工艺关键在于，制备浓度为1‑2mg/ml叶酸偶联壳聚糖溶液，将叶酸偶联壳聚糖溶于1%的冰醋酸溶液中，加入一定量的EGCG，用1%的NaOH溶液调节pH值3‑5，制成EGCG浓度为0.5‑1mg/ml的叶酸偶联壳聚糖溶液。取一定量TPP用纯水溶解，将TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液分别过0.45μm的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，叶酸偶联壳聚糖与TPP的比例为4‑6：1，最后得到负载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。

技术领域

本发明为一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）纳米粒的制备方法，属于食品生物技术领域。

背景技术

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是一种多酚类物质，具有降血脂、抗氧化、清除体内自由基等特殊生理功能功效。但由于EGCG不稳定，易受外界环境变化而降解或生成副产物，限制了其在各领域的应用。

目前国内外对叶酸偶联壳聚糖包埋EGCG的研究较少，利用叶酸的靶向性，使叶酸偶联壳聚糖，利用离子凝胶法制备得到叶酸-壳聚糖-EGCG纳米微球，增加EGCG的稳定性，提高EGCG的生物利用率。

在人类疾病发展史上，全球范围内，恶性肿瘤已成为严重威胁人类健康的主要疾病。目前的主要治疗方法药物选择性低，既杀伤肿瘤细胞，同时也会损害体内某些正常细胞，因而在治疗中常出现明显的毒性反应，影响疗效。所以，将靶向制剂用于肿瘤化疗具有明显的优势，且势在必行。

发明内容

技术问题本发明主要针对恶性肿瘤的防治，制备新型分子靶向药物和传递药物载体的链接。

技术方案本发明提供了一种叶酸-壳聚糖-表没食子儿茶素没食子酸（EGCG）纳米粒的制备方法，具体内容如下：

A、叶酸活性酯的制备：称取FA200-300mg，溶于5-10ml无水的DMSO中，加入DCC200-300mg和NHS100-200mg溶解，过夜后滤去DCU，滤液经减压蒸馏除去部分溶剂，搅拌中逐滴将滤液滴入冰冷的含30-40%丙酮的无水乙醚溶液中，得黄色沉淀DCU，滤液经旋转蒸发、真空冷冻干燥，得到叶酸活性酯；

B、壳聚糖的合成：称取CS100-200mg，溶于30-60ml醋酸-醋酸钠缓冲液（PH4.6），得到壳聚糖醋酸水溶液，在磁力搅拌下以2-3ml/min的速度缓慢向溶液中加入8-15ml叶酸活性酯的DMSO溶液（20mg/ml），30℃反应18-20h，离心，用蒸馏水洗涤沉淀数遍，重新将沉淀溶于2-4%的醋酸水溶液中，得到1-2mg/ml叶酸偶联壳聚糖溶液；

C、叶酸壳聚糖的分离纯化：取适量叶酸偶联壳聚糖溶液，低速离心后取上清液，用SephadexG-25葡聚糖凝胶层析柱进行分离，用2-4%醋酸溶液洗脱，流速1.5ml/min。在363nm波长检测洗脱，收集流出的第一个吸光峰值，冷冻干燥得叶酸偶联壳聚糖纯品；

D、叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液制备：将叶酸偶联壳聚糖溶于1-3%的冰醋酸溶液中，称取一定量的EGCG加入溶液中，用NaOH溶液调节pH值，制成EGCG含量为0.5-1mg/ml的叶酸偶联壳聚糖溶液；

E、纳米颗粒的制备：取一定量TPP用纯水溶解，保持叶酸偶联壳聚糖与TPP比例在4-6：1之间，将TPP溶液和叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液分别过0.45μm的滤膜，向匀速搅拌的叶酸偶联壳聚糖的EGCG溶液逐滴加入TPP溶液，得到载EGCG的叶酸壳聚糖纳米微球。

本发明的主要优点和积极效果如下：

1、利用叶酸的靶向性，使叶酸偶联壳聚糖。

2、利用离子凝胶法制备得到叶酸-壳聚糖-EGCG纳米微球，增加EGCG的稳定性，提高EGCG的生物利用率。