[发明专利]一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法

说明书

本发明提供了一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，采用延长锇酸固定时间和梯度渗透法达到切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于马铃薯块茎超微结构的研究。其步骤包括：（1）样品采集与固定；（2）漂洗；（3）后固定；（4）漂洗；（5）脱水；（6）浸透；（7）包埋；（8）聚合；（9）超薄切片；（10）双重染色。本发明提高了马铃薯块茎细胞超微结构的保存效果；提高了块茎样品的渗透效果；本发明中块茎样品的纯包埋剂浸透过程是放置在干燥器中进行的，可以使丙酮被彻底挥发掉，增加了树脂的切割性能，避免了由于树脂受潮发软而导致切片上出现波浪型条纹。

技术领域

本发明涉及超薄切片制作技术领域，具体地说是一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法。

背景技术

马铃薯（Solanum tuberosum L.）块茎既是无性繁殖器官，又是营养储藏器官。马铃薯块茎形成和发育的形态结构变化不仅是其生物学特性的重要内容，也对块茎产量和品质性状的形成具有重要影响。目前，运用透射电镜是观察生物超微结构最常用的方法，其中透射电镜超薄切片样品的制备是生物超微结构研究的关键，但是从取材到染色涉及多个步骤，任何环节出现问题都会影响到样品制备质量甚至导致样品制备失败。拥有一套最佳的关于马铃薯块茎的透射电镜样品制备方法，可以为块茎形成和发育的形态学研究提供技术支撑和理论依据，对马铃薯生产中产量和品质形成管理和控制具有重要意义。

现有技术存在的问题：有关马铃薯块茎形态学方面的研究，前人所用方法基本停留在光镜水平，偶有涉及透射电镜，也只是对所用方法大概的描述，步骤较为繁琐且效果不理想。作为植物材料，马铃薯块茎细胞含有细胞壁，富含淀粉，组织坚硬，包埋剂不易渗透，很难制备出高分辨的透射电镜样品，往往导致切片易破碎、细胞结构模糊或细胞器丢失等现象，从而限制了透射电镜在马铃薯研究中的应用。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明提供了一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片制作方法，采用延长锇酸固定时间和梯度渗透法达到切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于马铃薯块茎超微结构的研究。

为了达到上述目的，本发明采用了如下的技术方案：

本发明的目的在于避免现有技术的不足之处而提供一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片的制作方法。以解决切片完整，没有碎裂，透射电镜下观察结构清晰，细胞器结构完整，用于马铃薯块茎超微结构的研究。为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于透射电镜观察的马铃薯块茎超薄切片的制作方法，其主要特点在于包括以下步骤：

（1）样品采集与固定：用双面刀片切取马铃薯块茎上待研究部位处1 mm³大小的电镜样品，将其迅速放入2.5%戊二醛固定液中，置于4℃，固定24-48 h。

（2）漂洗：将步骤（1）固定好的块茎样品用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15 min。

（3）后固定：将步骤（2）漂洗好的块茎样品放入1%锇酸中进行后固定，置于4℃，固定5 h。

（4）漂洗：将步骤（3）1%锇酸固定后的样品，用0.2 M磷酸缓冲液漂洗3次，每次15min。

（5）脱水：先用50%、70%、80%、90%和100%乙醇进行逐级脱水，每次15 min；再用纯丙酮脱水2次，每次15 min。

（6）浸透：用包埋剂和纯丙酮混合液（1:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（2:3）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（1:1）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:2）室温浸透1 h，包埋剂和纯丙酮混合液（3:1）室温浸透1 h，然后用纯包埋剂室温浸透过夜，纯包埋剂的浸透放置在干燥器中进行。