[发明专利]一种L-氨基酸氧化酶的突变体

说明书

本发明公开了一种L‑氨基酸氧化酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过对来源于谷氨酸棒杆菌的L‑氨基酸氧化酶进行定点突变，获得突变体Q183A，将突变体Q183A在大肠杆菌中进行异源表达，得到的重组菌对L‑缬氨酸的催化效率提高了18.7％，α‑酮异己酸的产量达到54.6g/L，底物摩尔转化率为84.6％。本发明提供的全细胞转化方法较化学法相比，具有反应条件温和，目标产物单一，易于分离，对环境友好等优势，且工艺简单，便于控制，易于推广应用。

技术领域

本发明涉及一种L-氨基酸氧化酶的突变体及其制备方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

L-氨基酸氧化酶是一种能够催化L-氨基酸生成α-酮酸的氧化还原酶。研究人员对L-氨基酸氧化酶的空间结构、底物特异性、以及其对非天然底物的催化能力方面进行过大量的研究，近年来，该酶在生物转化生产α-酮酸方面的应用逐渐引起研究人员的关注。

α-酮酸是重要的中间体，它主要应用于食品、医药、化妆品等领域，这使得酶法转化α-酮酸在工业生产上有着广泛的应用。L-氨基酸氧化酶是黄素蛋白酶，L-氨基酸的氧化脱氨反应可以分为两个步骤：首先将氨基酸C^α上的氢转移给FAD，氨基酸变成亚氨基酸，亚氨基酸不稳定分解成α-酮酸和水。然后FADH₂被氧分子氧化后，变成了还原型FAD。L-氨基酸氧化酶底物谱广泛，催化效率高，这为异源表达氨基酸氧化酶转化L-缬氨酸生产α-酮异戊酸提供了可能。

然而，目前利用L-氨基酸改造的方法一定程度上提高了α-酮异戊酸的产量和转化率，但是产量依然很低，因此，为提高α-酮异戊酸的产量和转化率，增强其工业应用价值，急需提高L-氨基酸氧化酶对L-缬氨酸的催化效率。

发明内容

本发明要解决的第一个目的是提供一种L-氨基酸氧化酶的突变体，所述L-氨基酸氧化酶的突变体的氨基酸序列中含SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列，或者所述L-氨基酸氧化酶的突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第二个目的是提供编码所述L-氨基酸氧化酶的突变体的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述L-氨基酸氧化酶的突变体为Q183A，编码其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第三个目的是提供一种构建所述突变体的方法，所述方法包括：

(1)克隆谷氨酸棒杆菌来源的L-氨基酸氧化酶编码基因；

(2)连接(1)中得到的谷氨酸棒杆菌L-氨基酸氧化酶编码基因和pET系列载体，得到携带谷氨酸棒杆菌来源的L-氨基酸氧化酶基因的pET系列载体；

(3)在谷氨酸棒杆菌来源的L-氨基酸氧化酶同源建模的基础上，通过结构分析确定突变位点；以(2)中的连接产物为模板，设计定点突变的引物，进行定点突变PCR，得到突变质粒Q183A-pET系列载体，将突变后的质粒转化到大肠杆菌中表达。

本发明的第四个目的是提供一种提高L-氨基酸氧化酶对L-缬氨酸的催化效率的方法，所述方法是将谷氨酸棒杆菌来源的L-氨基酸氧化酶的第183位的氨基酸谷氨酰胺Gln突变成丙氨酸Ala。

在本发明的一种实施方式中，所述谷氨酸棒杆菌来源的L-氨基酸脱氨酶的Genbank登录号为AJE67504，含有380个氨基酸。

本发明的第五个目的是提供一种提高α-酮异戊酸产量的方法，是利用所述的L-氨基酸氧化酶突变体菌株作为全细胞催化剂，转化含L-缬氨酸的底物得到α-酮异戊酸。

本发明的一种实施方式中，将含有终浓度为25-35g/L的全细胞、终浓度为60-70g/L的L-缬氨酸、终浓度为20mM的Tris缓冲液(pH＝8.0)的转化体系，置于20-37℃条件下，反应20-24h。