[发明专利]基于雄激素受体识别元件和G-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法

说明书

基于雄激素受体识别元件和G‑四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法，属于分析化学和临床诊断技术领域。本发明利用雄激素受体(AR)对雄激素受体识别元件(ARE)的保护作用，当AR存在时与具有特定序列的双链DNA即ARE结合，同时借助杂交链式放大反应通过序列互补将大量G‑四链体结构聚集到固定在电极表面的含有ARE的DNA探针上。最后利用电极表面结合的具有氧化还原活性的G‑四链体‑血红素复合物与AR浓度呈正相关，通过电流值与AR浓度间的线性关系实现对AR的定量分析。该方法具有灵敏度高、专一性好等优点，并适用于对人血清等临床样本中AR浓度的定量分析。

技术领域

本发明涉及一种基于雄激素受体识别元件和G-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体的电化学方法，属于分析化学和临床诊断技术领域。

背景技术

雄激素是体内非常重要的类固醇激素，在体内主要为睾酮及少量脱氢表雄酮和雄烯二酮，在男性生殖系统中发挥着重要的生理学作用，如：影响男性生殖器官的发育和精子的发生和成熟，促进第二性征的出现及维持男性正常的性功能。而雄激素作用的发挥必须借助其受体—雄激素受体(androgen receptor, AR)，若无AR，则雄激素对组织无刺激反应，AR是雄激素作用的中介物质。研究表明，AR与前列腺癌、良性前列腺增生、肯尼迪病、男性不孕、雄激素不敏感综合症以及男性乳癌等疾病的发生、发展有密切关系。因此，研究一种高灵敏检测AR的方法，为临床提供更可靠的资料，对前列腺癌等疾病的研究和诊断有着重要的意义。

传统的AR检测方法有蛋白印迹、免疫组化和酶联免疫吸附法。蛋白印迹和免疫组化是典型的半定量检测模式，不能精确的测定受体含量。酶联免疫吸附法虽然可以定量检测，但是需要特异性标记的抗体，耗时且不经济。因而，建立操作简单便携、特异性好、灵敏度高的AR检测方法，对AR理论研究和临床诊断都具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是将蛋白-核酸识别技术、信号放大技术与生物传感技术相结合，用雄激素受体识别元件进行靶标识别，通过杂交链式进行信号放大，G-四链体-血红素复合物作为信号标记，建立了一种灵敏度高、特异性强的针对AR的检测方法。

本发明的技术方案，一种基于雄激素受体识别元件(androgen receptorresponse element, ARE)和G-四链体杂交链式放大反应检测雄激素受体(androgenreceptor, AR)的电化学方法，合理设计了两条具有特定序列的单链DNA探针P1和P2，用以构建雄激素受体AR结合探针ARBP；P1的5’端序列和P2的3’端序列互补，其杂交后形成一端为序列互补的双链DNA，其中包含雄激素受体识别元件ARE，并在末端带有巯基修饰，另一端为非互补的能够引发G-四链体杂交链式放大反应的单链末端区；通过自组装将ARBP的双链端以Au-S键固定至金电极表面，形成探针修饰的电极；利用AR与ARBP中ARE部分的特异性识别和结合屏蔽住ARBP本身含有的限制性内切酶NspI的酶切位点，避免NspI对ARBP的切割；在G-四链体杂交链式放大反应中，合理设计了四段G-四链体形成探针 Hp1、Hp2、Hp3和Hp4，Hp1和Hp2、Hp3和Hp4两两互补配对，不断自发地在ARBP的单链端形成两段具有极多数量G-四链体结构的杂交链，与血红素结合形成具有氧化还原活性的G-四链体-血红素复合物，其数量与AR的浓度密切相关；最后通过差分脉冲伏安法DPV测定峰电流值与AR浓度间的线性关系建立标准曲线；以同样的步骤和试剂对人血清样品中的AR进行检测。

在该方法体系中设计了六个特殊的DNA序列：形成ARBP的探针P1和P2，能够自组装形成G-四链体的四个G-四链体形成探针Hp1、Hp2、Hp3和Hp4。

特殊设计的P1和P2部分互补形成的ARBP中包含一段雄激素受体识别元件(androgen receptor response element, ARE)，其另一端以非互补的单链存在，为G-四链体形成探针的捕捉序列，分别与Hp1和Hp3部分互补，且互补区域的长度大于发夹DNA本身的茎环长度。