[发明专利]一种鉴定胸腔积液生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其应用。所述生物标记物为患者血清经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱(HPLC)得到的游离葡萄糖和甘露糖。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血进行HPLC仪分析便可区分正常人和患者，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速分析血清中游离的甘露糖和葡萄糖，并可以计算得到甘露糖、葡萄糖糖浓度及二者峰面积，对于研究血清游离甘露糖和葡萄糖与疾病之间的关系、寻找新型胸腔积液疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及用于鉴定胸腔积液的生物标记物及其检测应用。

背景技术

胸腔积液(pleural effusion)是以胸膜腔内病理性液体积聚为特征的一种常见临床症候。这种多余的液体可以通过限制肺的扩张来损害呼吸。各种胸腔积液，取决于液体的性质和导致其进入胸膜腔的原因，是胸腔积液(浆液)，血胸(血液)，尿胸(尿液)，乳糜胸(乳糜) 或脓胸(脓)。胸膜毛细血管内静水压增高(如充血性心力衰竭)、胸膜通透性增加(如胸膜炎症、肿瘤)、胸膜毛细血管内胶体渗透压降低(如低蛋白血症、肝硬化)，壁层胸膜淋巴回流障碍(如癌性淋巴管阻塞)以及胸部损伤等，均可引起胸腔积液。胸腔积液的鉴别诊断一直都是临床工作中的难题，早在1997年PET/CT就被报道可用于诊断MPE，但由于敏感度和特异度都差强人意，迄今未获推荐应用于实际的临床工作。胸腔镜对于诊断恶性胸腔积液的价值早已得到呼吸科和肿瘤科大夫的广泛认同，再结合应用荧光技术可探查微小的胸膜病变并准确地辨认病变范围，大大提高诊断的敏感度及阴性预计值。诊断恶性胸腔积液的金标准是在胸水或胸膜活检组织中找到恶性细胞，难题在于并非所有的恶性胸腔积液都能找到恶性细胞。因此，科学家们希望能找到无创的来提高诊断效率。如何精确识别胸腔积液的易感人群以便早期干预，或能否筛选合适的生物标志物以预测疾病治疗的效果或者预测疾病的进展等已成为热点问题。

人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常体检人群的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的 1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。目前没有文献报道柱前1-苯基-5-甲基吡唑啉酮(PMP)衍生的高效液相色谱法同时检测胸腔积液患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖。

因此，建立高效准确的血清中游离甘露糖的检测方法，对于研究血清游离单糖与疾病之间的关系、寻找疾病临床检测的标志物有着非常重要的意义。

单糖的PMP衍生法是目前较为常用的单糖检测方法。该方法包括以下几个步骤：(1) 为PMP创建碱性条件，(2)加入PMP，在70℃进行衍生，(3)调节衍生后的溶液pH，将残余PMP萃取出来。发明专利CN 103969371 B公开了“一种血液降解得到并检测单糖的方法在癌症检测中的应用”。该发明专利首先将血清样品通过酸降解，将其中的多糖和糖蛋白降解为单糖组分；然后经过PMP衍生和高效液相对降解后得到的8种单糖进行检测。相比降解前的血清，样品组分与性质已经发生巨大变化。虽然单糖的PMP衍方法在各个领域应用比较广泛，但目前尚无报道将该方法应用于胸腔积液患者的血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。