[发明专利]一种鉴定慢性乙型肝炎生物标记物的方法及其检测试剂盒

说明书

本发明提供了一种鉴定慢性乙型病毒性肝炎的生物标记物的方法及其检测试剂盒。所述生物标记物为血清中经过柱前1‑苯基‑5‑甲基吡唑啉酮(1‑Phenyl‑3‑methyl‑5‑pyrazolone，PMP)衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。本发明检测方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法。本发明的技术方案具有前处理简单，分析时间短，仪器价格合理，符合常规使用，操作步骤简单易学，检测结果准确性高，只需采血即可，并且所需血清量极少，采血量小于1mL等优点。所得结果显示此分析方法可以快速定量慢性乙型病毒性肝炎患者血清中游离的甘露糖和葡萄糖，对于研究血清游离甘露糖及葡萄糖与慢性乙型病毒性肝炎之间的关系、寻找新型慢性乙型病毒性肝炎临床检测标志物有着非常重要的意义。

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种鉴定慢性乙型肝炎的生物标记物的方法及其检测试剂盒。

背景技术

慢性乙型肝炎(Chronic viral hepatitis B，CVH)，简称慢性乙肝，是指乙肝病毒检测为阳性，病程超过半年或发病日期不明确而临床有慢性肝炎的表现者。临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等症状。慢性乙型肝炎是由乙型肝炎发展而来的。中国是乙肝患病的主要地区，目前每年约有100万新生儿携带乙型肝炎病毒(HBV)，相当数量的患者会由CVH发展为肝炎，肝硬化和肝癌。因此，及时的检查和阻断治疗是控制CVH进一步恶化的关键。CVH的诊断原则一般包含流行病学资料的筛查、临床表现、影像学检查和病理学检查，并结合血清中HBV标和HBV DNA检测结果。这些方法过程繁琐，检测灵敏度和特异性较低，因此需要一种新的检测分析方法来促进CVH的临床诊断。

人体血清中包含两种游离单糖，其中葡萄糖(Glc)含量最高，正常范围为3.9～6.1mmol/L，甘露糖(Man)含量约为葡萄糖含量的1％。真核细胞中，由14个单糖组成的寡糖(9个甘露糖，3个葡萄糖和2个N-乙酰葡糖胺)在内质网中转移到大多数新合成的蛋白质的N-糖链连接位点上。有研究报道，异常蛋白质糖基化与代谢性疾病、癌症等疾病有关。因此，测量人血清中游离单糖的含量将为CVH的诊断提供新型分子水平信息。人体血清游离单糖中葡萄糖的含量最高，正常人的范围为3.90～6.16mmol/L。目前，医院检验科可以直接通过测生化指标检测葡萄糖浓度，暂时不可以直接检测甘露糖浓度。健康成人血浆中游离甘露糖的浓度范围为20～80μmol/L。甘露糖的含量约为葡萄糖含量的1％。它大部分被认为是由细胞中的葡萄糖异构化而来。而近来有研究表明，细胞中流出的游离的甘露糖是哺乳动物血液中游离甘露糖的主要来源。这两部分来源的游离甘露糖维持着血清中甘露糖的稳定。D-甘露糖是糖蛋白，细胞表面糖缀合物和糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白等结构中必需的单糖。其中，甘露糖是各种多糖复合物中N-糖链的重要组分，N-聚糖中的甘露糖残基来源于血液中的葡萄糖或甘露糖。游离甘露糖是正常的血浆成分。目前，血清甘露糖的测定方法主要有酶法、气液色谱法、高分辨液相层析、气液色谱-质谱法和毛细管电泳法等。但这些方法均存在一定的不足之处。比如，使用酶法、气液色谱法和高分辨液相层析时，为避免高浓度的葡萄糖的影响需要将其去除，致使前处理过程比较繁琐；气液色谱-质谱法仪器价格昂贵，不适合常规目的；所需血清样本量大。

发明内容

本发明的目的是提供了用于鉴定慢性乙型肝炎的生物标记物及其应用，本发明采用柱前PMP衍生的高效液相色谱法(HPLC)检测慢性乙型肝炎患者血清中的单糖，尤其涉及血清中游离甘露糖和葡萄糖的检测。本发明的技术方案可以用于检测慢性乙型肝炎患者或正常人血清游离甘露糖和葡萄糖浓度，可以用于鉴定慢性乙型肝炎患者。

为实现本发明的目的，本发明通过以下技术方案予以实现：

用于鉴定慢性乙型肝炎的生物标记物，所述生物标记物为血清经过柱前PMP衍生的高效液相色谱得到的游离甘露糖和葡萄糖。

用于鉴定慢性乙型肝炎的生物标记物的定量分析方法，其特征在于：该方法为柱前PMP衍生的高效液相色谱法，包括以下具体步骤：