[发明专利]一种同时提取生物样品中极性和弱极性代谢物的方法

说明书

本发明公开了一种用于生物样本中极性和弱极性代谢物同时提取的方法，在待分析的生物样本中对极性和弱极性代谢物进行选择性富集。分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层，上层直接于nano‑LC‑MS非靶向分析多肽组，下层经干燥复溶后于LC‑MS非靶向分析弱极性代谢物和靶向分析诸如类固醇激素类成分的物质。本发明的优点在于可以通过少量生物样品一次性提取尽可能多的极性和弱极性代谢物，并进行非靶向和靶向代谢组分析，节约了生物样本用量，极性代谢物组和弱极性代谢物组来自同一样本，两者之间的相对重复性好于多次提取，便于多平台分析的数据整合。

技术领域

本申请涉及分析化学领域，具体涉及一种在生物样本中同时提取极性和弱极性代谢物并进行基于液相色谱-质谱联用的极性和弱极性代谢物分析的方法。

背景技术

生物体的代谢紊乱涉及众多疾病的发生发展，基于液相色谱-质谱联用的非靶向和靶向代谢组分析是研究疾病代谢标志物的重要手段。生物样本组成成分复杂，尤其是血浆含有高丰度蛋白质干扰物；在人体活体检查时获得的生物样本量有限，常用的小鼠模型可得到的血浆和组织样本亦很少；且极性和弱极性代谢物极性差异较大，使得同时提取较困难，分别提取的方法消耗生物样本量较大，且两者之间的相对重复性较差，不利于多平台分析的数据整合。因此需要在实际的代谢物组学分析中采用一种高效、节省组织用量的同时提取极性和弱极性代谢物组的提取方法。

目前，有机溶剂(甲醇、乙腈、丙酮等)的蛋白质沉降方法和有机溶剂(氯仿/甲醇、甲基叔丁基醚)萃取是生物样品前处理的常规技术，但对于组成及其复杂的生物样本，如血浆样本，高丰度蛋白去除不彻底，带来样本分析过程的污染问题和色谱分离柱的消耗问题，并且极难与高效毛细管液相色谱兼容分析血浆中代谢物；SPE和超滤膜成本较高，处理步骤繁琐、耗时较长。虽然在线SPE样品前处理简化了整个处理过程，手动操作步骤减少，但在线操作需要特殊设备，其维护和方法设置较复杂，且往往带来较长的色谱运行时间，因此，实验室和临床样本分析中很少用到。

针对目前常用生物样本提取方法存在的需要分别提取极性和非极性代谢物组；且很难与毛细管高效液相色谱兼容性差等不足，本发明发展了一种从生物样本中同时提取极性和弱极性代谢物的新方法，单次提取同时获得生物样本中极性和弱极性的代谢物，继而通过毛细管液相色谱-质谱和高效液相色谱-质谱方法进行生物样本代谢物组分析。

发明内容

本发明的目的在于建立一种在生物样本中同时获得极性和弱极性代谢物并用于nanoLC-MS和LC-MS分析的新方法。

该方法至少包括以下步骤：

(1)向生物样品加入酸性蛋白变性剂，定量移取并加入内标溶液，涡旋混匀，得到体系I；

(2)将步骤(1)中体系I进行极性和弱极性代谢物的选择性富集及杂质去除，得到体系II；

(3)将步骤(2)中的体系II进行有机溶剂萃取，分别收集富含极性代谢物的上层和富含弱极性代谢物的下层。

在优选的实施方式中，该方法还包括，将所述富含极性代谢物的上层进行毛细管液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析，将富含弱极性代谢物的下层进行超高效液相色谱-电喷雾离子化-质谱联用分析。

在该方法中，所述生物样品的体积为50μL～1200μL，酸性蛋白变性剂溶液用量为生物样品用量的0.1～1倍，优选地为0.1～0.4倍体积。

优选地，酸性蛋白变性剂选自磷酸水溶液、三氟乙酸水溶液、三氯乙酸水溶液中的至少一种。

优选地，所述酸性蛋白变性剂溶液的浓度为0.1v％～5v％。

在极性和弱极性代谢物选择性富集及杂质去除的步骤中，采用盐析辅助液液萃取。

在优选的实施方式中，将盐析辅助液液萃取试剂加入到步骤(1)中所述体系I中，振荡，涡旋，离心，取上层上清液。