[发明专利]一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法

权利要求书

1.一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，依次包括如下步骤：

1)采用仔猪大肠杆菌K88、K99双价基因工程活疫苗免疫SPF蛋鸡；

2)采用仔猪大肠杆菌性腹泻发病猪肠道分离物，产肠毒素大肠杆菌、肠毒素及黏附性菌毛蛋白混合免疫原对SPF蛋鸡进行免疫；

3)在步骤2)中的SPF蛋鸡免疫过程中喂食屎肠球菌Anp01(Enterococcus faeciumAnp01)CCTCCM209019及中药组合物，然后收集被免疫的鸡所产鸡蛋，从其蛋黄中提纯抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY；

所述步骤2)中，对SPF产蛋鸡进行免疫的步骤为：初次免疫前5日注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原进行免疫刺激，首免时注射1ml；2周后进行第二次免疫，分别注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原1ml；再隔2周进行第三次免疫，注射仔猪大肠杆菌病K88、K99双价基因工程活疫苗及混合免疫原2ml；再隔4周后进行第四次免疫，所述首免、第二次免疫、第三次免疫和第四次免疫均采用肌肉分点免疫；

步骤3)中，收集鸡蛋时间为步骤2)中首免后6～14周；

步骤3)中，提纯抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体采用聚乙二醇PEG-6000沉淀法，具体步骤为：依次分别用3.5％PEG-6000、8.5％PEG-6000、12％PEG-6000对卵黄抗体沉淀3次，最后用预冷的50％乙醇进一步沉淀，得到卵黄抗体提纯物；

步骤3)中，所述中药组合物的组成为：生黄芪10～20份、银花10～20份、柴胡5～15份、黄芩5～15份、板兰根10～20份、贯仲10～20份、苍术5～15份、生苡仁10～20份、防风5～15份、生甘草1～10份、藿香5～15份，粉碎过100～120目筛；

步骤3)中，所述屎肠球菌Anp01(Enterococcusfaecium Anp01)CCTCCM209019的添加量为饲料的0.1％，所述中药组合物的添加量为饲料的10％；

将步骤3)所述的鸡蛋，经75％酒精消毒后，用卵黄分离器分离蛋白，收集卵黄，弃卵黄膜，加卵黄液9倍体积的pH5.2酸化水稀释，充分搅拌，4℃冰箱中静置超过6h，在10000r/min4℃离心10min，收集上清液获得卵黄水提液；将所述卵黄水提液于-70℃冰箱中过夜，取出，解冻后10000r/min离心15min，弃去沉淀，收集上液，经0.22μm滤膜过滤后，获得抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体IgY。

2.如权利要求1所述的一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述SPF蛋鸡为20～30周龄。

3.如权利要求1所述的一种抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体的制备方法，其特征在于，步骤3)中，所述中药组合物的组成为：生黄芪15份、银花15份、柴胡10份、黄芩10份、板兰根15份、贯仲15份、苍术10份、生苡仁15份、防风10份、生甘草5份、藿香10份，粉碎过110目筛。

4.如权利要求1-3任一项所述方法制备的抗仔猪产毒大肠杆菌卵黄抗体。