[发明专利]一种具有ccdB负筛作用的菌株及其构建方法

说明书

本发明公开了一种具有ccdB负筛作用的菌株,所述菌株为去掉了F因子中ccdA基因和TetR基因的菌株。本发明还公开了具有ccdB负筛作用的菌株构建方法，包括以下步骤：(1)利用Red/ET同源重组技术将菌株中F因子上的ccdA和TetR基因替换为FRT‑Kan cassette‑FRT DNA序列，得到基因编辑后的F因子；(2)提供表达FLP重组酶的质粒，通过所述质粒表达的FLP重组酶介导重组反应，删除所述基因编辑后的F因子上两个FRT位点中间的外源序列，即得所述具有ccdB负筛作用的菌株。本发明构建的菌株具有ccdB负筛作用，可应用于基于Gateway和Golden Gate等技术的载体构建，该菌株对重复序列等复杂片段具有良好的稳定复制能力。

技术领域

本发明涉及基因载体技术领域，尤其是一种具有ccdB负筛作用的菌株及其构建方法。

背景技术

NEB商业化的Stable菌株与目前公司常用的Stbl3菌株相比，具有很多优点：1.感受态转化效率高达1～3×10⁹cfu/μg；2.适用于逆转录病毒/慢病毒载体克隆的克隆；3.适用于克隆一些困难片段，如直接重复或反向重复序列的克隆；4.可减少克隆DNA的随机重组几率(recA1)；5.适用于真核生物来源的甲基化DNA或PCR来源的非甲基化DNA、cDNA的高效转化；6.失活非特异性核酸内切酶I(endA1)，以获得高质量的质粒制备物；7.具有对噬菌体T1的抗性；8.适用于蓝白斑筛选。

ccdB是一种自杀基因，对于不含gyrA462或者ccdA基因的普通克隆菌株如Top10、Stbl3、DH5a等具有致死作用，故只能存在于ccdB T1survival T1、T2或者DB3.1(gyrA462)等菌株中。基于该特性，ccdB作为一种高效的负筛基因被广泛应用于基于Gateway和GoldenGate技术的载体构建中。在这些骨架载体中，ccdB和氯霉素基因位于Gateway和GoldenGate载体的克隆位点之间，当ccdB和氯霉素基因被目的序列取代后，正确质粒可在普通克隆菌株中进行复制，而未能与目的序列反应的骨架载体则会使菌株死亡，故而LB平板上长出来的都是阳性克隆，阳性率可达到100﹪。Stable菌株作为一种具有高效感受效率及对复杂不稳定序列具有天然耐受性的菌株，在实际应用中能够很好的解决一些困难项目，提高生产效率。然而由于Stable菌株的F因子中包含Tn10(TetR)转座子，其中的ccdA和Tet^R基因分别赋予菌株产生对ccdB致死基因和四环素的抗性，所以对转化到其中的四环素抗性载体或者基于ccdB负筛的载体构建不能起到筛选的效果，LB板上长出来的基本是背景克隆，导致阳性率低下，甚至无法筛选出阳性克隆。

F质粒(F plasmid)，又称为F因子或致育因子，是一类存在于大肠杆菌等细菌中的单拷贝接合型质粒，通常为100多kb。带有F质粒的细胞为雄性细胞，与之对应的不含F质粒的为雌性细胞，雄性细胞可通过性菌毛介导的接合过程将F质粒转移到雌性细胞中，从而使雌性细胞转变为雄性细胞。该质粒以整合或游离的形式存在于菌株中，其中携带的特定基因能够改变菌株的特性。鉴于F质粒比较大，用常规的构建方法根本无法完成对其的改造，故在本发明中特引入一种基于Rac噬菌体RecE/RecT或λ噬菌体Redα/Redβ/Redγ的大肠杆菌体内DNA同源重组系统--Red/ET同源重组技术。该技术的特点是在同源重组酶大量表达的情况下，两端带有50bp同源臂的目的序列可与靶同源区域产生同源重组反应，从而产生预期的特定位点缺失、插入、点突变等。