[发明专利]基因改造的干细胞及其应用

说明书

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因改造的干细胞及其应用。本发明提供了基因改造的干细胞，该干细胞能够表达融合蛋白Pdx‑1‑Linker‑IGF‑1，能够高效分化成为胰岛样细胞团。实验表明，诱导5天转化率可达90％，胰岛素分泌量可达125±16pg/mL。与其他各组相比，经基因转化后的干细胞具有更强的胰岛细胞转化效果。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及基因改造的干细胞及其应用。

背景技术

糖尿病(Diabetes Mellitus,DM)是一组以高血糖为特征的代谢性疾病。高血糖则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。

据世界卫生组织推荐的分型，可将糖尿病分为以胰岛素绝对不足为主的I型糖尿病和以胰岛素相对不足且胰岛素抵抗为主的II型糖尿病两种类型。其中，约10％的患者属于I型糖尿病，遗传因素在该型糖尿病中的重要性高达50％，发病常见于儿童和青少年人群。另外，90％的患者属于II型糖尿病，是一种多基因遗传因素、环境因素联合作用引起的代谢性疾病，具有很高的遗传倾向，多见于40岁以上的成年患者。

目前在糖尿病的临床治疗上，通过注射胰岛素来控制血糖虽然是一种有效的缓解措施，但并不能彻底治愈糖尿病，还有可能造成低血糖等风。真正根治糖尿病将是恢复机体内功能性胰岛β细胞的数量和消除糖尿病引发的各种并发症。其中，进行胰岛移植是治疗I型糖尿病和部分II型糖尿病最有效的方法之一。但是，由于供体来源严重不足以及器官移植将面临终身免疫抑制治疗等问题，极大地限制了胰岛移植在临床治疗上的广泛应用。

近年来，由干细胞体外定向诱导分化成胰腺祖细胞和功能性胰岛来进行移植，为我们提供了一个全新的细胞替代疗法。自体诱导分泌胰岛素细胞微球可以有效的缓解病人的痛苦，同时该技术是以自体间充质干细胞为基础，能够从根本上避免免疫排斥问题以及其他传染性疾病的困扰，并且利用自体细胞可以更有效的发挥其修复作用，使移植细胞更好的与胰岛相结合，并最终替代损伤的胰岛细胞，进而达到修复其功能的作用。但是，目前的技术对干细胞的诱导效率较低，尚无法满足临床的应用。因此，应进一步研究，提高干细胞体外定向诱导分化成为分泌胰岛素的细胞的效率。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供基因改造的干细胞及其应用，该干细胞体外定向分化为分泌胰岛素的细胞的效率较高。

由于骨髓干细胞本身具有可诱导成型的特点可将其改造成胰岛素分泌性细胞，但是普通诱导方法效果并不是很好，因此采用慢病毒转基因加后期诱导的方法，对干细胞进行改造。

本发明提供了一种融合蛋白Pdx-1-Linker-IGF-1，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

Pdx1基因是胰十二指肠同源盒基因-1，是控制胰腺细胞正常发育和维持胰岛素正常分泌的基因。Pdx-1基因最终转录为Pdx-1蛋白，其具有283个氨基酸，分子量约为31kDa。主要利用氨基端和胰岛素基因启动子区域结合，进而调控胰岛素基因的转录以及表达，同时引导胰岛素mRNA从细胞核中转移到核外。IGF-1胰岛素样生长因子是具有促进生长的多肽结构的分泌性激素，多功能细胞调控因子，对细胞的生长，促进组织的发育和细胞转化，以及生理代谢等起到了极强的作用。

本发明充分利用Pdx-1和IGF-1的特性，设计了以G3S(即GGGS，G:甘氨酸，S:丝氨酸)为柔性链接的表达Pdx-1和IGF-1的融合蛋白。通过基因表达慢病毒载体，将Pdx-1于IGF-1的融合基因嵌入到干细胞基因组中，促使干细胞最终能表达Pdx-1-Linker-IGF-1融合蛋白。通过G3S柔性链连接到一起的融合蛋白同时具有Pdx-1和IGF-1两个蛋白的性质，既可以促进干细胞分泌胰岛素同时又具有定向促进细胞的生长，并且能够很好的促进干细胞像类胰岛细胞及组织进行转化，从而达到修复胰岛组织的作用。