[发明专利]一种高效分离脐带胎盘间充质干细胞的方法及应用

说明书

本发明涉及干细胞领域。本发明初步建立一种脐带、胎盘干细胞分离培养培养体系及应用。所述方法包括：（1）新生胎儿脐带、胎盘的处理与运输；（2）脐带、胎盘冲洗、切割、消化处理；（3）原代细胞及组织快细致处理；（4）全新添加物、传代换液处理。本发明可以在节约成本的基础上更高效率分离培养脐带、胎盘间充质干细胞。

技术领域

本发明涉及干细胞领域，尤其是分离培养人脐带、胎盘间充质干细胞的方法，在培养中我们添加了胎盘组织液，最大程度上模拟了细胞原本生长环境，使得细胞起步更平稳、增殖更快。

背景技术

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞的发育阶段分为两类:胚胎干细胞和成体干细胞。间充质干细胞（MSC），是一种具有自我复制能力和多向分化潜能的成体干细胞，这种干细胞能够发育成骨、软骨、脂肪和其他类型的细胞。可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，尤其对治疗衰老和组织器官损伤修复有很大的临床应用价值。最初MSC提取大多数来自骨髓，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓 MSC 移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性大，直接影响了骨髓MSC的临床应用，替代骨髓MSC的间充质干细胞来源迫在眉睫。

脐带、胎盘是产妇生产后的“废弃物”。脐带包括一条静脉和两条动脉，周围是Wharton’s Jelly，外层由羊膜来源的上皮包裹。胎盘起源于胚胎发育期胚外中胚层，由羊膜层、蜕膜层等组成。脐带的Wharton’s Jelly、胎盘的羊膜层和蜕膜层中有着丰富的间充质干细胞，而且相对骨髓间充质干细胞具有更高的增殖能力，更低的免疫原性以及更高的分化潜能，而且采集过程简单，无任何危害损伤及伦理学困扰。以上原因使脐带、胎盘间充质干细胞更适合临床的应用。但是，脐带、胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，传统的方法不仅对脐带、胎盘来源细胞伤害大，回收效率低，杂细胞多，细胞增殖速率慢，而且污染风险大，本发明恰恰从来源上保证安全无污染，而且提供了一个简单和高效的脐带、胎盘组织分离、培养、冻存间充质干细胞的方法，足以满足医药、科研、临床等领域的需求。

发明内容

本发明的目的是解决现有获取脐带、胎盘间充质干细胞方法的缺陷，提供一种实用简单的从脐带、胎盘中大量分离间充质干细胞的方法。本发明采用方法回收率和纯度，增殖能力比传统方法都有显著提高，而且无污染确保在临床中的安全应用。

1.来源上，我们选取经过严格身体筛查的产妇及胎儿的脐带、胎盘，确保健康，确保没有遗传病、确保没有感染性疾病及病原体携带，确保无污染，并且会留有产妇及胎儿信息留档以便查证；

2.脐带、胎盘取出后经由专业有资质的人员处理，用含有青链霉素和咪康唑的生理盐水将脐带、胎盘表面的血渍初步清洗干净，避免红细胞裂解，造成细胞内物质污染脐带、胎盘组织，将脐带、胎盘放入保存液中，低温冷链2-8℃全程监控快速运输到实验室，即到即处理（72h内）；

3.脐带、胎盘组织进入实验室必须遵守严格制度，登记相应表格，交由专业人员快速用含有青链霉素和咪康唑的PBS溶液冲洗胎盘组织，洗去残留的保存液和血渍，选取质量较好部分，用经过121℃，103.4kPa灭菌的手术器械，剥离组织块；

4.将组织块进一步切割成1-3mm³大小浸润在PBS溶液中，组织消化液37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h；

5.根据方法4，组织消化液包含胰蛋白酶、胶原酶Ⅱ、Ⅳ、分散酶、EDTA、脂肪酶中的一种或多种酶，0.25%胰酶、0.05-0.2%的EDTA、 0.1-1%胶原酶Ⅱ、Ⅳ、0.1mg/mL分散酶、0.1-0.2%脂肪酶，相对单一酶消化效率显著提高；

6.根据方法4，37℃，摇床处理10-30min，室温静置20-40min，2-8℃静置冷消化12-24h，方法多元，更加适合大量样本处理；