[发明专利]一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂、制备方法及其在焦化废水中的应用

权利要求书

1.一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂，其特征在于：微生物复合制剂包括弗氏柠檬酸杆菌（Citrobacterfreundi）和恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），所述弗氏柠檬酸杆菌由中国工业微生物菌种保藏管理中心保藏，弗氏柠檬酸杆菌的保藏编号为：CGMCC No. 1.173；所述恶臭假单胞菌由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，恶臭假单胞菌的保藏编号为：CICC 21906。

2.一种如权利要求1所述的氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S1、制备液体发酵培养基：称取原料：3.0g~5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g~10.0g氯化钠、0.03gMnSO₄·H₂0、0.7g氯化钾、1.0gNH₄NO₃，将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中，调节混合溶液的pH值为7.0~7.2，121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min；

制备固体斜面和平板培养基：称取原料：3.0g~5.0g牛肉膏，10.0g蛋白胨，5.0g~10.0g氯化钠、17.0g~18.0g琼脂，将称取的原料溶解于1000mL蒸馏水中，调节混合溶液的pH值为7.0~7.2，121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min；

S2、制备湿菌体：首先，将保存于-20℃的弗氏柠檬酸杆菌和恶臭假单胞菌菌株分别取出，在超净工作台上于凝固备用的固体斜面培养基中划线，30℃恒温培养48h；然后，待培养基中长出单菌落，再将活化的菌株挑取白色单菌落转进10mL液体培养基中，30℃恒温环境中以170r/min摇床培养18h；最后，将活化后的弗氏柠檬酸杆菌和恶臭假单胞菌培养液分装在已灭菌的离心管中，放入离心机中在4℃环境中离心40min，离心机转速为4000r/min，离心后将上清液倒掉，倒置离心管10min，即可获取柠檬杆菌和恶臭假单胞菌湿菌体，用无菌水将菌体重悬至0.1g/mL；

S3、制备氧化石墨烯纳米复合材料载体：

①、氧化石墨烯的合成：首先，称取1.0g石墨粉和0.5g 硝酸钠加入到23mL浓度为98%的浓硫酸中，冰浴冷却到0℃~5℃，强烈搅拌混合液的同时将3.0g 高锰酸钾缓慢加入混合液中，控制混合液温度不超过20℃，反应2h；其次，将混合液从冰浴环境中取出后移入水温为35℃的恒温水浴锅中隔水保温12h，然后在混合液中缓慢加入46mL二次蒸馏水，将混合液移到80℃~98℃的恒温油浴锅中保温15min~40min；再次，将混合液用二次蒸馏水稀释到140mL，加入2.5mL浓度为30%的双氧水，将混合液搅拌后过滤，并用二次蒸馏水洗涤3次；最后，将洗净的混合物在70℃环境中真空干燥12h；

②氧化石墨烯水溶液的制备：在蒸馏水中加入10mg氧化石墨粉末，配制成一系列浓度为0.05%wt.~ 0.3%wt.的氧化石墨烯水溶液，超声分散60 min，离心去除水溶液中的大颗粒后备用；

S4、制备固定化微生物复合制剂：

①、向容积为50mL的两口烧瓶中加入20 mL步骤S3配置好的氧化石墨烯溶液，然后向氧化石墨烯溶液中加入0.5%wt.明胶、0.42%~0.84%wt.丙烯酸，于100℃恒温水浴锅中搅拌3小时使其充分溶解混合，121℃环境中以205.8kPa压力灭菌30min；

②、待溶液在无菌条件下冷却后，加入步骤S2中获得的弗氏柠檬酸杆菌菌液1mL和恶臭假单胞菌菌液1mL，充分混合均匀后，加入过硫酸铵20mg、已二酸双酯2~3mg，搅拌后在氮气保护气氛围中培养30min，再加入N，N，N'，N'-四甲基二乙胺20μL，混合均匀后将溶液快速倒入模具中，室温交联反应12h；

③、取出交联后的小球，用生理盐水冲洗3次后，即得氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂，收集备用。

3.根据权利要求2所述的一种氧化石墨烯纳米复合材料固定的微生物复合制剂的制备方法，其特征在于：所述步骤S2中，无菌水中菌体的数量为6.33×10⁹~1.9×10¹⁰个/mL。