[发明专利]一种免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒的制备方法

说明书

本发明公开了一种免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒的制备方法，将小反刍兽疫N蛋白基因和Ag85A基因重组到复制缺陷性腺病毒上，以提高N蛋白刺激机体产生抗体的能力。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒的制备方法。

背景技术

小反刍兽疫（pestedespetitsruminants,PPR）是由副粘病毒科麻疹病毒属的小反刍兽疫病毒引起的一种高度接触性传染病，俗称“羊瘟”。本病主要发生于山羊、绵羊及野生小反刍动物，发病率和病死率均较高，世界动物卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物疫病，中国列为一类动物疫病。1942年该病首次发现于非洲的科特迪瓦，随后的几年时间PPR几乎传遍了赤道到撒哈拉沙漠的所有非洲国家。随着该病的不断蔓延，中国周边国家（老挝、孟加拉国、俄罗斯、印度、巴基斯坦、塔吉克斯坦、哈萨克斯坦、蒙古国、缅甸、尼泊尔、阿富汗和韩国）频频大规模暴发PPR疫情。2007年，西藏阿里地区首次暴发了本病，此后逐渐在我国蔓延开来。

目前，PPR防控主要以弱毒疫苗免疫为主。1989年，Diallo等将PPRVNigeria75/1株接种于Vero细胞上，连续传代，成功地将Nigeria75/1致弱，研制出第一株PPRV的同源弱毒疫苗，该疫苗目前仍在非洲地区广泛使用。我国发生小反刍兽疫疫情后，很快生产出小反刍兽疫弱毒活疫苗（75/1株），用于紧急接种和日常接种。弱毒苗的使用，使疫情得到有效控制。由于弱毒苗是细胞传代致弱的，存在毒力反强的可能性，因此探索安全有效的新型疫苗对防控工作来说是必须的。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒的制备方法，将小反刍兽疫N蛋白基因和Ag85A基因重组到复制缺陷性腺病毒上，以期提高N蛋白刺激机体产生抗体的能力。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒的制备方法，包括如下步骤：

S1，将脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列IRES连接到复制缺陷型腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA上,然后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-

IRES；

S2，将含有小反刍兽疫N蛋白的DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A基因的DNA序列克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上，而后提取重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-N-IRES-Ag85A；

S3，将提取得到的重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-N-IRES-Ag85A和复制缺陷型腺病毒pacAd59.2-100骨架DNA经线性化后，转染真核细胞AD-293，得到重组腺病毒rAd-N-IRES-Ag85A；

S4，将所得到的重组腺病毒rAd-N-IRES-Ag85A经浓缩、纯化、扩增，制备得免疫原性增强型小反刍兽疫N蛋白基因重组腺病毒。

进一步的，所述步骤S2中，小反刍兽疫N蛋白的DNA序列和含有结核分枝杆菌Ag85A基因的DNA序列以共表达的形式克隆至重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES上。

进一步的，所述步骤S2中，转染真核细胞AD-293的过程是在脂质体的作用下共同完成的。

进一步的，重组腺病毒穿梭质粒pacAd5CMVK-NpA-IRES的具体制备方法如下：

S1.1，核糖体结合位点序列IRES的获得：根据GenBank数据库发表的脑心肌炎病毒的核糖体结合位点序列ID:gb|EF591488.1，合成脑心肌炎病毒的核糖体结合位点IRES序列，并在IRES序列的两端加入酶切位点EcoRI与BamHI，获得质粒pEx-IRES；