[发明专利]一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于生物条形码的microRNA‑7a电化学检测方法及应用。首先利用磁珠标记链霉亲和素修饰的捕获探针形成MB‑CP1结构，金纳米标记巯基修饰的信号探针和条形码形成Au‑RP1‑barcode结构。在目标物的存在下，MB‑CP1,Au‑RP1分别与目标物两端互补，形成“三明治”结构，利用二硫苏糖醇释放金纳米上面的条形码。生物传感器由连接在金电极上亚甲基蓝修饰的信号探针RP2与捕获探针CP2杂交组成，加入释放的条形码与捕获探针杂交，信号探针中修饰亚甲基蓝的一端与金电极接近，产生了信号电流，从而间接定量检测了目标物。本发明选择性好、灵敏度高、在癌症标记物的检测中有着重要的应用价值。

技术领域

本发明涉及一种基于生物条形码的microRNA-7a电化学检测方法及应用，属于分子生物学和核酸化学领域。

背景技术

MicroRNA（miRNA）作为一种非常重要的非编码蛋白的RNA，广泛存在于植物、病毒、哺乳动物当中。在细胞增殖、细胞死亡、肿瘤发生和哺乳动物细胞生长中起着重要的调节功能， miRNA序列短序列相似性高，含量低，因此发展灵敏选择性好的miRNA检测方法十分有必要，也为疾病的早期诊断提供新思路。

生物条形码技术（BCA）以纳米颗粒为基础的扩增技术，由于经过多次信号放大，检测灵敏度非常高，其高灵敏度主要来自两个方面：（1）数以万计的条形码DNA 修饰于金纳米颗粒上，从而使针对每个捕获目标的检测灵敏度放大了2 ~ 4 个数量级；（2）每个条形码DNA 均可使用核酸检测方法完成另一个信号放大。因此，随着相关技术的进一步发展，BCA技术必将在人类肿瘤或其他疾病的诊断中得到广泛应用。

生物传感器是传感器的一个分支，以生物活性材料（蛋白质、抗体、核酸等）作为敏感元件与目标物分析反应，以电极作为转换装置，输出与目标物浓度相关的电信号作为检测信号，由于其具有高灵敏度和高选择性，被广泛应用到生物分析化学领域中。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于生物条形码的miRNA-7a电化学检测方法及应用。

具体步骤为：

（1）纳米金合成制备：移取100 mL质量百分比浓度为0.01%的氯金酸溶液倒入圆底烧瓶中，将其放置油浴锅中加热煮沸后迅速加入3 mL 质量百分比浓度为1%的柠檬酸钠溶液作为还原剂，继续加热15分钟，观察溶液的颜色从最初的淡黄色逐渐变成酒红色，最后停止加热冷却至室温，并且全程处于搅拌状态下进行，得浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液；通过扫描电子显微镜表征可知纳米金的粒径为16nm。

（2）金标记识别信号探针以及条形码（Au-RP1-barcode）的制备：取2.5μL浓度为10μmol/L的信号探针RP1与50μL~275μL浓度为10 μmol/L的条形码混合后加入202.5 μL含10mmol/L 三(2-羧乙基)膦（TCEP）浓度为10 mmol/L pH 5.8~7.4的磷酸盐缓冲溶液（PBS）中活化2小时，活化完毕后加入0.5 mL步骤（1）所得的浓度为5.8 nmol/mL金纳米溶液，立即震荡均匀并迅速裹上锡纸避光孵育16小时；接着加入9.1 μL质量百分比浓度为10% 的十二烷基硫酸钠（SDS）溶液，使最终质量百分比浓度为0.1 %；再加入101.6μL浓度为0.1mol/L pH7.4 PBS溶液，使其最终浓度为10 mmol/L；再加入53.5μL浓度为2 mol/L 的NaCl溶液，使其最终浓度为0.1mol/L。在孵育24小时后使用高速离心机离心（10000 转/分钟，20分钟），分散至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中并重复清洗3次，去掉上清液，最后分散0.5 mL至含0.1 mol/L NaCl浓度为10 mmol/L pH 7.4 PBS溶液中，震荡均匀，放置在4℃的黑暗环境中得Au-RP1-barcode溶液。

所述的信号探针RP1为巯基修饰的DNA序列，其碱基序列为：5´-SH-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTAACTATACAAC-3´。