[发明专利]禽流感分型的可视化芯片

权利要求书

1.一组禽流感病毒分型检测探针和PCR引物，其特征在于：所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-8所示，所述PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.9-24所示；

其中，H5亚型探针的序列如SEQ ID NO.1所示，H5亚型PCR引物的序列如SEQ ID NO.9-10所示；

H7亚型探针的序列如SEQ ID NO.2所示，H7亚型PCR引物的序列如SEQ ID NO.11-12所示；

H9亚型探针的序列如SEQ ID NO.3所示，H9亚型PCR引物的序列如SEQ ID NO.13-14所示；

N1亚型探针的序列如SEQ ID NO.4所示，N1亚型PCR引物的序列如SEQ ID NO.15-16所示；

N9亚型探针的序列如SEQ ID NO.5所示，N9亚型PCR引物的序列如SEQ ID NO.17-18所示；

N2亚型探针的序列如SEQ ID NO.6所示，N2亚型PCR引物的序列如SEQ ID NO.19-20所示；

禽流感病毒NP基因探针的序列如SEQ ID NO.7所示，禽流感病毒NP基因PCR引物的序列如SEQ ID NO.21-22所示；

λ定位基因探针的序列如SEQ ID NO.8所示，λ定位基因PCR引物的序列如SEQ IDNO.23-24所示。

2.根据权利要求1所述禽流感病毒分型检测探针和PCR引物，其特征在于：所述探针的5’端连接有一个氨基。

3.根据权利要求1所述禽流感病毒分型检测探针和PCR引物，其特征在于：所述PCR引物中的下游引物的5’端带有生物素标记。

4.一种检测禽流感病毒的可视化基因芯片，其特征在于：包含基质膜和权利要求1所述禽流感病毒分型检测探针。

5.根据权利要求4所述的检测禽流感病毒的可视化基因芯片，其特征在于，所述基质膜为醛基修饰的硅晶片或玻璃。

6.一种如权利要求4所述的检测禽流感病毒的可视化基因芯片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)设计探针位置的阵列；

(2)稀释权利要求1所述禽流感病毒分型检测探针；

(3)使用芯片点样系统按照步骤(1)中的阵列对基质膜点上对应的步骤(2)的探针，在芯片背面用记号笔沿着探针阵列画框；

(4)紫外交联6～12min，37℃水合过夜；

(5)使用封闭液进行封闭，然后清洗晾干、置于4℃保存备用。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：步骤(5)所述的封闭液包含：0.2％-1％的BH₄Na和20％-30％的乙醇。

8.一种非疾病诊断目的的禽流感病毒可视化检测方法，其特征在于：它是使用权利要求4所述的检测禽流感病毒的可视化基因芯片实现的。

9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于：包括如下步骤：

A)DNA扩增：将样本DNA使用权利要求1所述PCR引物扩增，扩增后将产物混匀；

B)杂交：将A)中混合产物高温变性5分钟，立即冰浴3min，滴加到含围栏固定的芯片阵列区域，静置，超纯水冲洗，室温下晾干；

C)孵育：在芯片阵列区域加入Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液在37℃孵育30min，超纯水冲洗，室温下晾干；

D)银染：避光加入银染试剂，静置，超纯水清洗，自然晾干；

E)判读：对应探针区域出现黑点，即可判定为检测阳性。

10.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：步骤B)的静置温度是35-55℃，静置时间为60-150min。

11.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：步骤C)的Nanogold-Streptavidin链霉亲和素溶液浓度是1-10μg/mL。

12.根据权利要求9所述的检测方法，其特征在于：步骤D)的静置时间是3-9min。