[发明专利]一种喹喔啉类荧光探针的制备方法及其在检测G-四链体中的应用

说明书

本发明提供一种喹喔啉类荧光探针的制备方法及其在检测G‑四链体中的应用，其结构式为：，式中R1采用N‑甲基哌嗪基、吗啉基和二乙胺基中的至少一种，R2采用F、甲基，R3采用F、甲基、N‑甲基哌嗪基和三氮唑基中的至少一种。与现有技术相比，本发明具有以下优点：（1）该类探针制备简单，易得，并且结构稳定，便于储存。（2）本发明提供的探针可以特异性地检测G‑四链体结构，实现了G‑四链体结构与其他二级结构的区分，用简单的荧光光谱仪，甚至无需任何仪器，肉眼观察就可以识别出核酸样品的二级结构，快捷，操作简便，成本低廉，并且可以实现实地检测。（3）该探针对待检测的核酸二级结构没有明显的影响，能够准确检测核酸原有的结构。

技术领域

本发明涉及一种新型G-四链体荧光探针的制备方法，以及其在检测G-四链体核酸二级结构的用途。

背景技术

G-四链体是由富含鸟嘌呤(G)的核酸序列通过自身装配而形成的特殊核酸高级结构。生物信息学等研究表明，在染色体端粒末端、癌基因的启动子区域、核糖体DNA以及mRNA的非翻译区域等重要调控区域均存在大量可以形成G-四链体的潜在序列(putativequadruplex sequence，PQS)，而且越来越多的证据表明G-四链体参与调控多种重要的生物学过程，如端粒末端保护、DNA复制、转录和翻译等，并且在细胞增殖、凋亡与衰老、肿瘤的发生及发展过程中都扮演着重要的调控角色。G-四链体被认为是起到分子开关的功能，其形成和拆散可能涉及到信号传导、细胞凋亡和细胞增殖等一系列体内重要的生理过程。因此，能够特异性地检测出G-四链体结构的存在或者形成，对于研究G-四链体结构的相关生物学功能以及开发以G-四链体结构为靶点的抗癌药物等方面都具有非常重要的作用。

然而，现阶段对G-四链体的研究只涉及到较少的基因序列，仍有大量G-四链体潜在序列(PQS)有待实验证明。而且，对于细胞内G-四链体的具体行为，也需要进行深入研究。因此，开发能够对G-四链体结构进行快速确证的方法和工具显得尤为重要。用于G-四链体检测的小分子探针也成为现阶段的一个研究热点。

近年来，喹喔啉结构被广泛应用于生物医药、半导体、荧光染料等领域。喹喔啉的平面性和刚性共轭结构使其具有独特的光学性质。申请人将喹喔啉结构融合到菲环结构当中，得到了新型的G-四链体探针，通过分子内电子转移的控制来进行G-四链体的检测，该探针荧光性能稳定，灵敏性高。

发明内容

为了解决以上技术问题，本发明提供了一种荧光探针，其结构式为：

式中R₁采用N-甲基哌嗪基、吗啉基和二乙胺基中的至少一种，R₂采用F、甲基，R₃采用F、甲基、N-甲基哌嗪基和三氮唑基中的至少一种。

本发明还提供一种制备探针的方法，包括以下几个步骤：

步骤A:用与N-甲基哌嗪或吗啉或二乙胺在DMSO溶剂中反应，得到化合物

步骤B:在乙醇溶剂中将其与进行反应，得到化合物

步骤C:将与叠氮化钠进行取代反应，生成

步骤D:将与炔基化合物在叔丁醇/水混合溶剂中进行点击反应，可得终产物或者将中间体与N-甲基哌嗪或吗啉或二乙胺在DMF中进行取代反应，可得终产物

其反应式为：

本发明采用以上技术方案，其优点在于，本发明提供的探针由于具有较大的电子共轭体系和刚性平面，与G-四链体结构发生作用后，可以比较容易堆积在G四分体的平面上，并且与G-四链体具有较强的作用力，影响探针分子内的电荷转移效应，电子从激发态回到自身基态，从而发生强烈荧光。当与其他二级结构的核酸作用时，比如双链DNA，较大的刚性平面可以阻碍探针与双链DNA沟槽的结合，或者阻碍其插入碱基平面，电子辐射跃迁受阻，从而荧光增强较弱。