[发明专利]一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法

说明书

本发明涉及细胞荧光检测领域，本发明主要提供一种可适用于FLIPR的不需要洗脱细胞外荧光物质的方法。为了实现上述发明目的，本发明采用在细胞装载荧光染料后加入淬灭剂Amaranth，提出一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法。本发明的优点如下：（1）实现了细胞在测量前不用置换液体；（2）本发明非常经济实惠，整个检测过程成本占现有技术成本的10%‑20%；（3）本发明整个操作过程简单，可用于高通量筛选。

技术领域

本发明涉及细胞荧光检测领域，特别涉及一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法。

背景技术

高通量筛选是药物发现中很重要的环节。在筛选分析过程中，细胞外部介质的更换经常是耗费时间的一步。同时在这一步骤，细胞的丢失也是容易发生的事故。在细胞介质中添加而不是更换通常更容易操作。

细胞内钙离子的变化是广泛应用的监测细胞表面受体激活的有效指标。用于此技术的荧光标记物Fluo-4在和细胞内游离的钙离子结合后，它的荧光发射波长会发生变化。但残留在细胞外面的Fluo-4和钙离子结合会干扰细胞内的信号。如果在细胞外有淬灭剂，特异性地屏蔽掉细胞外的信号，就会极大的简化实验过程。

目前，国内外也尝试用各种方法来实现不用置换细胞外介质的方法，我们急迫需要开发一种经济实用的用于均一体系细胞荧光检测钙流方法。

发明内容

本发明主要提供一种可适用于FLIPR的不需要洗脱细胞外荧光物质的方法。为了实现上述发明目的，本发明采用在细胞装载荧光染料后加入淬灭剂Amaranth，提出一种用于均一体系细胞荧光检测钙流方法。

包括如下步骤：

a. 称取Amaranth粉末，溶解在FLIPR缓冲液（1xHank’s缓冲液+20 mM HEPES, pH 7.4）中，得到25 mg/ml溶液；

b. 取10 μl Fluo-4AM (2 mM) 和10 μl pluronic acid (20% in DMSO)混匀，加入到10.5 ml FLIPR缓冲液中，再加入10.5 μl小牛血清，

c. 如果细胞像CHO一样有阴离子泵（organic anion transporter，还需要在FLIPR缓冲液中加入probenecid (终浓度 2.5 mM)

d. 在96孔板的每孔加入100 ul荧光染料溶液，放回培养箱温浴0.5h-48h后再加入100μl Amaranth溶液，这也是与现有技术的不同之处（以F8NW NO Wash Calcium Assay Kit为例)，目的是为了减小淬灭剂Amaranth对细胞的毒性。

进一步地，还包括前期准备步骤和后续FLIPR分析步骤。

进一步地，所述前期准备步骤如下：准备细胞板：将CHO-M5以每孔60000个细胞的密度种在96孔板中（孔板类型为四周黑色，底部透明），培育16-24小时。

进一步地，所述前期准备步骤如下：准备细胞板：将HEK-M4细胞以80000个/孔的密度种在96孔板中（孔板类型为四周黑色，底部透明），培育16-24小时。

进一步地，所述后续FLIPR分析步骤如下：细胞为CHO细胞，将孔板中的培养基全部吸出，加入100 μl的荧光染料溶液，37℃孵育0.5h-48h后，再次吸出孔板里的液体，加入100μl的FLIPR缓冲液（含Amaranth），然后根据实验需求加入药物后进行FLIPR分析。

优选地，所述后续FLIPR分析步骤如下：细胞为CHO细胞，将孔板中的培养基全部吸出，加入100 μl的荧光染料溶液，37℃孵育1h后，再次吸出孔板里的液体，加入100μl的FLIPR缓冲液（含Amaranth），然后根据实验需求加入药物后进行FLIPR分析。