[发明专利]一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物及扩增方法

说明书

本发明公开了一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物及扩增方法，通用引物包括6对引物，其中包括1对扩增长片段引物和5对扩增普通片段引物；扩增方法为：以提取的枪乌贼科物种基因组DNA为模板，首先用扩增长片段引物进行LA‑PCR扩增，用扩增普通片段引物进行普通PCR扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖电泳检测后测序，序列拼接、校对，即得线粒体基因组全序列。本发明通用引物覆盖完整线粒体基因组全序列，能对枪乌贼科物种进行整体拼接，能够与模板碱基序列结合紧密，扩增效率高，能够保证扩增结果的可信度；本发明扩增方法的扩增效率高、扩增片段长、保真性高，能够获得枪乌贼科物种线粒体全基因组序列。

技术领域

本发明涉及分子标记技术领域，尤其是涉及一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物及扩增方法。

技术背景

线粒体是细胞内的能量转换器，拥有独立于核基因组序列的线粒体基因组。不同于核基因组，线粒体基因组具有多个特征：(1)分子较小，且存在长度多态性，不同于基因组序列，线粒体基因组的序列由于串联重复序列的存在而大小不；(2)编码效率高，由于没内含子的存在，线粒体基因组序列短，但包含大量基因；(3)拷贝数多，每个细胞中含有不少于1000个线粒体基因组；(4)遗传和复制相对独立性，几乎不受细胞核的控制；(5)高突变率，由于线粒体数量的大量变化，线粒体DNA几乎在整个细胞的生存过程中都在复制，这导致了线粒体DNA上出现了大量的变异碱基，且这些突变不会危及到细胞的生存，突变碱基会保留下来；(6)同质性与异质性，每个个体细胞中的线粒体基因组DNA序列存在原始序列和突变序列，并且存在一定分配比例；(7)母系遗传，有性繁殖的个体中仅卵细胞存在大量线粒体，精子几乎不含有线粒体，因此一个个体的线粒体基因全部来自母本。这些特征为科技工作者研究生物的生存、进化、物种迁徙等提供了有利条件。

头足类种类繁多，主要可以分为柔鱼类、枪乌贼类、乌贼类和蛸类，其中枪乌贼类(枪乌贼科)已取代乌贼类成为主要的优势种，是当前重要的渔业捕捞对象，相对于其它经济鱼类过度利用的渔业状况，其资源仍具有一定的利用潜力。不仅具有很高的经济价值，而且在海洋生态系统中起着重要作用，特别是小型枪乌贼类是能量在海洋生物中进行传递和转换的重要通道。枪乌贼线粒体基因组为环状双链DNA，在细胞中存在成千上万的拷贝，尤其在生长状态较好的细胞中大量存在，线粒体DNA的数量在一定程度上反映了细胞的生活状态。研究表明枪乌贼线粒体的DNA非常保守，物种间的差异较小。枪乌贼线粒体基因组非常小，约为15-20Kb之间，仅占整个个体全部基因信息(核基因组和线粒体基因组)的1％。枪乌贼线粒体基因组主要包括37个编码基因(13个蛋白基因，2个核糖体RNA(rRNA)基因，22个转运RNA(tRNA)编码基因，2个转录和复制起始区域。基因编码的蛋白包括了与线粒体内膜相结合的酶复合体的亚单位：细胞色素、ATP合成酶的亚基、细胞色素氧化酶的亚基以及氢化辅酶I脱氢酶的亚基。由于线粒体DNA缺少蛋白保护，加上高复制效率，缺乏校对机制等，导致线粒体DNA的序列变异效率高，而个体的异质性(突变DNA和原始DNA的比例)和线粒体序列的多态性(长度多态性，单个碱基位点多态性)可作为一个物种的分子标记，借此进行类群识别、物种起源进化、物种迁徙等研究。目前为止，进行线粒体基因组多态性研究的方法包括：(1)直接测序；(2)内切酶图谱；(3)扩增长度多态性；(4)探针杂交法等。随着测序技术的发展及测序费用的降低，直接测序方法已经越来越方便快捷，目前，枪乌贼线粒体基因组主要通过设计通用引物，进而获得枪乌贼线粒体DNA的全序列。因此引物设计的好坏直接决定了实验的成败，因此开发一个简便、通用的枪乌贼线粒体基因组测序的方法具有重要的实用价值。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种覆盖完整线粒体基因组全序列，能对枪乌贼科物种进行整体拼接，能够与模板碱基序列结合紧密，扩增效率高，能够保证扩增结果的可信度的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物。

本发明的目的之一在于提供一种扩增效率高、扩增片段长、保真性高，能够获得枪乌贼科物种线粒体全基因组序列的枪乌贼科物种线粒体全基因组的扩增方法。