[发明专利]一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物及扩增方法

权利要求书

1.一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物，其特征在于：所述通用引物包括6对引物，所述通用引物包括1对扩增长片段引物和5对扩增普通片段引物。

2.根据权利要求1所述的一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物，其特征在于：所述扩增长片段引物为：

LAF：5’-TAATCCTCAGTGAGACCAATGAATCT-3’，

LAR：5’-GGTCCACAGATCATAACGAATATGG-3’。

3.根据权利要求1所述的一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物，其特征在于：所述扩增普通片段引物为：

F1：5’-TAGAGCATAGTAGGGTATCTAATCCTAGT-3’，

R1：5’-TGTACAACATCACTGTAACCCGTTCA-3’；

F2：5’-GGTCAACAGATCATACAGTTATTGG-3’，

R2：5’-CATACTTCAGGGTGACCATAGACTCT-3’；

F3：5’-CTCCAGATATAGCTATCACG-3’，

R3：5’-TGCGTCTCCTCCACCTCAT-3’；

F4：5’-TTACTTCTATTCTGAGTCCT-3’，

R4：5’-TCGATATACAATTGCGTCTACG-3’；

F5：5’-GGTCGACACATCATAGAGATATTGG-3’，

R5：5’-TAACTTCAGCGTGACCAAGGCATCC-3’。

4.根据权利要求1所述的一种用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物，其特征在于：所述枪乌贼科物种包括中国枪乌贼、日本枪乌贼、剑尖枪乌贼、福氏枪乌贼、皮氏枪乌贼、莱氏拟乌贼、杜氏枪乌贼、尤氏枪乌贼、神户枪乌贼、乳光枪乌贼、火枪乌贼。

5.一种权利要求1所述的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的设计，其特征在于：从Genbank数据库中下载目前所有已经公布的枪乌贼科物种线粒体全基因组序列，对这些序列进行多重比对，找出比较保守的区域以及变异较大的区域，并在两段保守区域设计通用引物。

6.一种基于权利要求1所述的通用引物的枪乌贼科物种线粒体全基因组的扩增方法，其特征在于：以提取的枪乌贼科物种基因组DNA为模板，首先用扩增长片段引物进行LA-PCR扩增，用扩增普通片段引物进行普通PCR扩增，PCR产物经1.0％琼脂糖电泳检测后送生物公司测序，然后对测序的结果进行序列拼接、校对，即得线粒体基因组全序列。

7.根据权利要求6所述的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的扩增方法，其特征在于：所述LA-PCR扩增采用50ul体系，包括1ul 20uM F引物、1ul 20uM R引物、8ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、0.5ul 5U/ul LA-Taq酶、2.5ng DNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。

8.根据权利要求6所述的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的扩增方法，其特征在于：所述LA-PCR扩增的反应条件为：93℃预变性5min；92℃变性30s，53℃退火30s，70℃延伸600s，扩增20个循环；然后继续在93℃变性30s，53℃退火30s，70℃延伸610s，扩增20个循环；70℃总延伸10min。

9.根据权利要求6所述的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的扩增方法，其特征在于：所述普通PCR扩增采用50ul体系，包括1ul 20uM F引物、1ul 20uM R引物、4ul 2.5mM dNTP、5ul 10×buffer、3ul 25mM MgCl₂、0.25ul 5U/ul Taq酶、2.5ng DNA模板、灭菌蒸馏水加至50ul。

10.根据权利要求6所述的用于枪乌贼科物种线粒体全基因组扩增的通用引物的扩增方法，其特征在于：所述普通PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸50s，扩增30个循环；72℃总延伸7min。