[发明专利]一种检测猪病毒性腹泻症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒

说明书

本发明涉及检验检疫领域，旨在提供一种检测猪病毒性腹泻症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒。该试剂盒中包括：(1)反转录和预扩增混合液：反转录和预扩增引物的序列如SEQ ID NO：1～12所示；其中，反转录引物为12碱基随机引物；(2)多重连接探针混合液：其中，探针的序列如SEQ ID NO：13～24所示，通用引物的序列如SEQ ID NO：25～26所示；(3)MLPA缓冲液；(4)连接缓冲液A和B；(5)连接酶Ligase‑65；(6)PCR反应混合液，其包括序列表SEQ ID NO:25～26所示的通用引物；(7)SALSA聚合酶；(8)阴性对照；(9)阳性对照，包含6种猪病毒性腹泻症候群的病原的阳性对照质粒。与现有方法比较，本发明具有高通量、节省费用、特异性好、灵敏度高的优点。

技术领域

本发明提供了一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪博卡病毒(PBoV)和猪诺如病毒(NoV)6的多重连接探针扩增鉴别检测试剂盒，可实现同时检测6种引起猪病毒性腹泻症候群的病原，属于检验检疫领域。

背景技术

猪病毒性腹泻是目前危害我国养猪业最重要的疾病，猪病毒性腹泻可危害任何年龄猪只，特别是多发生在每年12月份至翌年1～2月的哺乳和断奶仔猪，其发病率和死亡率都较高，并且发病和传播迅速，比较难以控制，极大的危害着规模化养殖场的猪群安全，给养猪业带来重大损失[1]。一旦感染该病，仔猪常表现出水样腹泻、脱水直至死亡，发病率和死亡率非常高，常给养殖场带来毁灭性打击。猪病毒性腹泻症候群的常见病原为：猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)、猪轮状病毒(porcinerotavirus,RV)、猪delta冠状病毒(porcine delta coronavirus,PDCoV)、猪博卡病毒(porcine bocavirus,PBoV)、猪诺如病毒(swine norwalk viruses,NoV)等六种病毒引起的。由于该症候群发病迅速，需短时间内确定致病原因并进行预防和治疗，目前尚没有一种方法可以一次性对引起猪病毒性腹泻的多种疾病病原体进行鉴别诊断。

因此建立一种能精准、快速、高效区分不同病原的检测方法，对于猪猪病毒性腹泻的预防和发生至关重要。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种检测猪病毒性腹泻症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒。该试剂盒为临床提供了可同时检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(RV)、猪delta冠状病毒(PDCoV)、猪博卡病毒(PBoV)和猪诺如病毒(NoV)的检测手段。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

提供一种检测猪病毒性腹泻症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒，该试剂盒中包括：

(1)反转录和预扩增混合液：

该混合液包含反转录和预扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～12所示(见表1)，分别用于反转录和预扩增；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

(2)多重连接探针混合液：

该混合液包括探针和通用引物；其中，探针的序列如SEQ ID NO：13～24所示(见表2)，通用引物的序列如SEQ ID NO：25～26所示(见表3)；

(3)MLPA缓冲液；

(4)连接缓冲液A和B；

(5)连接酶Ligase-65；

(6)PCR反应混合液，其包括序列表SEQ ID NO:25～26所示的通用引物；