[发明专利]一种检测猪病毒性腹泻症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒

权利要求书

1.一种检测猪病毒性腹泻症候群病原核酸的MLPA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中包括：

（1）反转录和预扩增混合液：

该混合液包含反转录和预扩增引物，其序列如SEQ ID NO：1～12所示，分别用于反转录和预扩增；其中，反转录引物为12碱基随机引物；

（2）多重连接探针混合液：

该混合液包括探针和通用引物；其中，探针的序列如SEQ ID NO：13～24所示，通用引物的序列如SEQ ID NO：25～26所示；

（3）MLPA缓冲液；

（4）连接缓冲液A和B；其中，连接缓冲液A包括Coenzyme NAD；连接缓冲液B包括Tris-HCl、MgCl₂、non-ionic detergent；

（5）连接酶Ligase-65；

（6）PCR反应混合液，其包括序列表SEQ ID NO:25～26所示的通用引物；

（7） SALSA聚合酶；

（8) 阴性对照；

（9) 阳性对照，包含猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒和猪诺如病毒阳性对照质粒；

所述序列SEQ ID NO：1-2是猪博卡病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：3-4是猪诺如病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：5-6是猪delta冠状病毒预扩增引物；所述序列SEQID NO：7-8是猪流行性腹泻病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：9-10是猪轮状病毒预扩增引物；所述序列SEQ ID NO：11-12是猪传染性胃肠炎病毒预扩增引物；所述序列SEQ IDNO：13-14为检测猪博卡病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：15-16分别为检测猪诺如病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：17-18分别为检测猪delta冠状病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：19-20分别为检测猪流行性腹泻病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：21-22分别为检测猪轮状病毒的左侧探针和右侧探针；所述序列SEQ ID NO：23-24分别为检测猪传染性胃肠炎病毒的左侧探针和右侧探针；其中，所述SEQ ID NO：14、16、18、20、22、24的5’端进行磷酸化处理；所述序列SEQ IDNO：25、26分别是通用PCR扩增的正向和反向引物。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，试剂盒中的阳性对照来自病毒核酸RNA经反转录后，其特异基因片段与质粒连接所得的重组质粒混合物；其中特异基因分别为猪流行性腹泻病毒的S基因、猪传染性胃肠炎病毒的N基因、猪轮状病毒的NSP1基因、猪delta冠状病毒的N基因、猪博卡病毒的NS1基因和猪诺如病毒的RdRp基因。

3.利用权利要求1所述试剂盒同时检测6种猪病毒性腹泻症候群病原核酸的非诊断目的MLPA扩增检测试方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）磁珠法提取样品DNA、RNA；

使用磁珠DNA、RNA共提取试剂盒和全自动核酸提取仪，同时提取样品中的DNA和RNA，得到200 µL样品；

（2） RNA反转录成cDNA及预扩增

进行一步法反转录RT-PCR反应；

配制25 μL反应体系：10 μL OneStep Ahead RT-PCR Master Mix，1 μL OneStepAhead RT-Mix，5 μL DNA或RNA，1 μL随机反转录引物和5 μL预扩增引物混合液，终浓度为每条引物0.5 μM，3 μL H₂O补足；

反应条件：50℃ 10 min，95℃ 5 min；95℃ 15 s，55℃ 20 s，72℃ 20 s，40个循环；72℃ 2 min；

（3） MLPA扩增和检测

a)DNA变性

取0.2 mL PCR反应管，每管加入0.5 μL DNA溶液和4.5 μL TE，98℃变性5 min，降至室温25℃；

b)探针与样本DNA的杂交

配制3 μL混匀的探针混合液：1.5 μL MLPA缓冲液 + 1.5 μL探针混合液；

将探针混合物加入上述PCR反应管中，95℃温育1 min，60℃杂交1-16 h，54℃温育；

c)杂交探针的连接

配制32 μL连接酶混合物：25 μL dH₂O + 3 μL 连接缓冲液A + 3 μL 连接缓冲液B + 1μL连接酶Ligase-65；

PCR仪温度降至54℃，打开管盖，加入32 μL连接酶混合物，54℃温育15 min，98℃加热5min灭活连接酶，20℃温育；

d)连接探针的PCR扩增

配制10 μL PCR混合液：7.5 μL dH₂O + 2 μL PCR反应混合液 + 0.5 μL SALSA聚合酶；

取出PCR管，室温下加入10 μL PCR混合物；开始PCR反应，反应条件为：95℃ 30 s，60℃30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃孵育20 min，降至15℃；

e)全自动核酸分析仪分析：

PCR扩增产物取20μL，用全自动核酸分析仪进行分析；

（4）结果描述及判定

a） 质控标准：

阳性对照在102 bp、110 bp、117 bp、124 bp、131 bp、138 bp处有特异性扩增条带；

阴性对照无特异性扩增条带；

如阴性对照和阳性条件不满足以上条件，此次试验视为无效；

b） 结果判断：

阳性：在102 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪博卡病毒；在110bp 处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪诺如病毒；在117 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪delta冠状病毒；在124 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪流行性腹泻病毒；在131 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪轮状病毒；在138 bp处有特异性扩增条带，表示样本中存在猪传染性胃肠炎病毒；同时可对MLPA扩增产物进行测序，进一步确认；

阴性：无特异性扩增条带，表明样品中无猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪轮状病毒、猪delta冠状病毒、猪博卡病毒、猪诺如病毒。