[发明专利]一种新疆出血热病毒多表位真核表达载体pVAX-MEPX2的构建及应用

说明书

本发明公开了一种在制备新疆出血热药物应用的重组真核表达载体，通过新疆出血热病毒多表位双拷贝基因片段MEPX2与真核表达载体pVAXⅠ组合而成真核表达载体，合理的表位设计提高了免疫效力，并且具有将免疫反应集中于保守表位的能力，通过在免疫动物试验得知其具有良好的免疫原性。该重组质粒作为DNA疫苗与蛋白质疫苗联合免疫后的抗体水平、细胞免疫水平和免疫效果优于单一抗原单独免疫。通过选择新疆出血热病毒YL04057株多表位双拷贝基因片段MEPX2与真核表达载体pVAXⅠ重组成真核表达载体并与蛋白质疫苗联合免疫，克服了单一抗原产生的免疫保护效果差的缺点，具有良好的开发应用前景。

技术领域

本发明涉及分子生物学和微生物学领域。具体地讲，本发明涉及一种新疆出血热病毒多表位真核表达载体的构建及其应用。

背景技术

克里米亚刚果出血热(Crimean-Congo hemorrhagic fever，CCHF)是由克里米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus，CCHFV)引起的急性蜱传人畜共患病，该病毒属于布尼亚病毒科内罗病毒属。据报道有5-40％的患者表现为严重出血，引起休克甚至死亡。在中国，首个CCHF病例于1965年被报道，因此该病又被称为新疆出血热(Xinjiang hemorrhagic fever，XHF)。目前已从新疆巴楚地区患者中分离到病毒株，该地区被认为是我国CCHF发病率最高的地区。由于XHFV的高毒力和高致病性，其研究需要在高水平的实验室中进行，导致缺乏合适的动物模型，使针对XHF有效的诊断、预防和治疗方法的深入研究受到限制。

新一代疫苗如重组亚单位蛋白和DNA疫苗，正逐步替代传统疫苗。基于多表位的疫苗通常选择保守的具有免疫优势和中和保护功能的表位进行串联表达，减少了无关序列的干扰和抑制。由于其具有成本低、操作简单、安全性高且保护效力更高等特点而受到广泛关注。有研究报道，多个抗原表位串联组成的多表位串联体构成得到表位疫苗效果要强于单个表位疫苗，开展多表位基因串联及表达活性相关研究对研制病毒新型表位疫苗具有重要意义。

发明内容

针对现有技术未见有关采用基于pVAX-MEPX2重组真核表达载体及其在新疆出血热疫苗中应用报道的技术现状，本发明旨在提供一种多表位真核表达载体的制备以及在新疆出血热疫苗中的应用。有鉴于此，本发明提供了一种多表位真核表达载体。该真核表达载体是由双拷贝基因片段MEPX2和插入真核表达载体pVAXⅠ组合而成。本发明的目的之一在于提供一种应用于新疆出血热疫苗中的多表位真核表达载体，其免疫后可诱导实验动物产生特异的体液免疫和细胞免疫；目的之二在于提供所述的pVAX-MEPX2多表位真核表达载体的制备方法；目的之三在于提供的免疫试验证明该多表位真核表达载体与蛋白质疫苗联用的联合免疫手段能够有效的预防新疆出血热感染。

为解决上述的技术问题，本发明通过以下技术方案实现。

本发明利用已分离的新疆出血热病毒株YL04057中的6个线性B细胞表位经柔性肽串联后，经串联重复成为双拷贝基因片段优化得到MEPX2基因片段，插入真核表达载体pVAXⅠ制备成预防新疆出血热的疫苗，通过在实验动物中应用验证得知，其与蛋白质疫苗联合使用后的免疫抗体水平、细胞免疫水平和对实验动物小鼠的免疫效果好于传统的蛋白质疫苗单独免疫，克服了单一抗原产生的免疫效果差的缺点。

本发明具体提供一种在制备新疆出血热疫苗应用的重组真核表达载体，该载体是由新疆出血热病毒多表位双拷贝基因片段MEPX2与真核表达载体pVAXⅠ组合而成，该多表位真核表达载体的具体制备方法步骤如下：

(1)基于新疆出血热病毒YL04057株单拷贝基因序列MEPX以及经反复串联的双拷贝基因序列MEPX2的前后分别加入BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点进行优化；

(2)将步骤(1)中优化后的基因片段进行碱基合成；