[发明专利]一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺

说明书

本发明公开了一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺，属于生物工程技术领域。本发明通过对奇异变形杆菌来源的氨基酸脱氨酶突变体进行密码子优化和发酵条件优化，氨基酸脱氨酶酶活显著提高。进一步对转化条件进行优化，显著提高苯丙酮酸的产量，当湿菌体添加量25～30g/L，苯丙酮酸产量可以达到81.1～83.0g/L，苯丙氨酸的摩尔转化率达到98.0％以上。

技术领域

本发明涉及一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺，属于生物工程技术领域。

背景技术

苯丙酮酸PPA是一种常用于医药、轻工等领域的双羟基化合物，可以用于制作复方α酮酸片；PPA是合成D-苯丙氨酸的原材料，D-苯丙氨酸是手性药物和食品添加剂的合成中间体；PPA还可以用于制备苯乳酸，苯乳酸可以用于抗菌防腐和风味添加剂。

PPA作为一种多功能有机酸，目前主要使用化学合成法和生物法生产，化学合成法通常有α-乙酞氨基肉桂酸水解、乙内酰脲与苯甲醛合成法和氯苄经双羟基化反应三条路线。但是化学合成法存在反应需要高，产品得率低、设备投资大，反应时间长且会产生有毒有害物质等问题。生物法生产PPA具有许多优势：易制备，成本低；更稳定，使用方便；无污染，副产物少。PPA的生物法生产可以采用直接发酵法和酶转化法生产。根据文献报道，鲁氏酵母(Zygosaccharomyces rouxii)、普通变形杆菌(Proteus vulgaris)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)和摩氏摩根菌(Morganella morganli)可以直接发酵生产PPA，其中P.vulgaris通过分批发酵产量可以达到3.0g/L。但由于菌体内PPA的路径较长，代谢路径酶活低，直接发酵法PAA产量相对较低，且发酵液中含有大量菌体、蛋白质、无机盐等杂质，PPA的下游分离纯化工艺复杂。利用生物酶制剂转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸是目前的研究热点。

酶转化法可以利用苯丙氨酸脱氢酶、氨基酸转移酶和L-氨基酸脱氨酶转化L-苯丙氨酸生产苯丙酮酸，Hou等在大肠杆菌中异源表达来自Proteus mirabilis KCTC 2566的L-AAD，PPA的产量为2.60±0.1g·L^-1，转化率为86.7％。又经过PPA降解途径改造和L-AAD分子改造，最终使PPA产量提高至30.00±1.2g·L^-1，转化率达到100％。还建立了两阶段全细胞转化策略，利用两阶段温度调控策略，即：低温诱导12h，添加底物L-苯丙氨酸，提高温度至转化温度，至反应结束，然后收集菌体，进行静息细胞转化，有效实现了PPA的积累。另外，研究者还对E.coli FAD合成和再生系统进行代谢改造强化、构建FADH₂/FAD再生系统，进一步提高PPA的产量至58g·L^-1。

发明内容

为了进一步提高PPA的产量，本发明提供了一种酶转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺。

发明人之前在申请号为201810670959.4的专利申请中已经公开了通过基因工程构建得到可以利用L-氨基酸脱氨酶高产苯丙酮酸的突变株，其苯丙酮酸产量可以达到72.5g/L。本发明进一步对L-AAD转化苯丙氨酸生产苯丙酮酸的工艺进行优化，显著提高苯丙酮酸的产量，适用于工业化生产苯丙酮酸。

本发明的第一个目的在于提供一种重组菌，所述重组菌，以大肠杆菌为宿主、采用pET系列载体表达了氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示、核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的氨基酸脱氨酶突变体。

本发明的第二个目的在于提供一种高密度发酵生产L-氨基酸脱氨酶的方法，所述方法是应用上述重组菌进行发酵生产。