[发明专利]一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法

说明书

本发明公开了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9‑15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6‑BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。本发明方法可有效防止甘蔗外植体褐化现象的产生，且不影响外植体的生长分化，是甘蔗健康种苗组织培养的一种有效方法。

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体地说，涉及一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法。

背景技术

甘蔗原产于热带、亚热带地区，是重要的糖料及能源作物，每年世界上总产量80％的蔗糖和40％的乙醇原料均来自于甘蔗。甘蔗系无性繁殖宿根栽培作物，易受甘蔗花叶病，宿根矮化病及黄叶病等的病原物反复侵害，使得品种退化，产量及含糖量下降。为了使优良品种的种性得以恢复，构建了甘蔗综合脱毒技术体系，用此技术体系所示的方法所生产的甘蔗脱毒健康种苗可以完全脱除以上病原菌并使甘蔗增产20-40％，蔗糖含量提高0.5-1.0％。此项技术体系中，甘蔗的组织培养是甘蔗脱毒健康种苗生产成功与否的关键因素之一，但是在甘蔗组织培养的过程中，外植体褐化现象普遍存在，严重影响外植体分化，严重的甚至导致外植体死亡。

目前，甘蔗外植体防褐化技术研究的比较少，且多见于在培养基中添加抗氧化物质，从而降低外植体的褐化率。秦昌鲜等2011年在“防止甘蔗组织培养褐化初探”一文中提出，在培养基中添加生物素和硅酸钠，可推迟甘蔗外植体褐化出现时间，减轻褐化程度。吴转娣等2013年在“甘蔗胚性愈伤组织的诱导和抗褐化研究”中指出，在培养基中加入PVP或活性炭，能够有效减轻甘蔗组织的酚害，进而降低外植体褐化率。

发明内容

有鉴于此，本发明针对现有甘蔗组织培养过程中，外植体存在褐化现象的问题，提供了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法。

为了解决上述技术问题，本发明公开了一种甘蔗组织培养中外植体防褐化的方法，将成熟甘蔗茎秆从上至下的9-15位芽经消毒，用抗氧化剂浸泡后剥取茎尖分生组织得到外植体，将外植体以MS+6-BA为基础培养基培养，即可有效抑制甘蔗外植体的褐化。

进一步地，所述外植体的采集步骤包括：选取生长健壮、无病虫害的成熟甘蔗茎秆，剥去外叶鞘，截取从上至下9-15位间的单芽，52℃水浴30min后，38-40℃恒温培养，待腋芽长至8-12cm，将其切下，经消毒及抗氧化处理后，在无菌水或1％的无菌柠檬酸溶液中剥取茎尖1-2mm分生组织，即得到所述甘蔗外植体。

进一步地，所述消毒方法为：先用无菌水清洗1-2次，用滤纸吸干水分后放入体积浓度为70-75％酒精中浸泡0.5-1min，之后放入加有2-3d、0.1％吐温20的0.1％升汞溶液中处理10-15min，期间搅拌3-4次，最后用无菌水清洗3-4次。

进一步地，采用抗氧化剂浸泡时间为15-30min。

进一步地，所述抗氧化剂为聚乙烯吡咯烷酮、抗坏血酸、硫代硫酸钠、亚硫酸钠、柠檬酸或磷酸丁脂中的一种。

进一步地，所述MS+6-BA培养基为：将1mg/L6-BA加入到MS培养基中，调节pH至5.8，121℃下高压蒸汽灭菌20-25min即得。

进一步地，所述MS培养基为：硝酸钾1.9g/L，硝酸铵1.65g/L，七水合硫酸镁0.37g/L，磷酸二氢钾0.17g/L，氯化钙0.332g/L，四水合硫酸锰22.3mg/L，七水合硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，碘化钾0.83mg/L，二水合钼酸钠0.25mg/L，五水合硫酸铜0.25mg/L，六水合氯化钴0.025mg/L，乙二胺四乙酸二钠3.73mg/L，七水合硫酸亚铁2.78mg/L，甘氨酸0.2mg/L，维生素B1 0.05mg/L，维生素B6 0.1mg/L，烟酸0.05mg/L，肌醇0.01g/L。

进一步地，所述6-BA为：6-苄基腺嘌呤1mg/L。