[发明专利]一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法

说明书

本发明涉及一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法，针对现有PacBio核酸测序平台应用于扩增子扩增的文库构建中，存在试剂成本高、步骤复杂等技术问题，该方法基于扩增子样本的扩增原理，结合PacBio测序技术特征，针对每个待测样本在第一步扩增中引入反向互补的标签序列，使同一次扩增的扩增子都标记有标签序列，将带有不同标签的扩增子混合，标签序列在后续文库构建中一直保留，因此该方法可实现多个扩增子样品仅需一次文库构建，简化了实验操作流程，提高了建库效率，降低了测序成本。本发明在设计标签序列时，使每种样本的两个引物5’端添加的标签序列反向互补，测序时两端均可识别出标签序列，极大提高扩增子样本的标签序列识别效率。

技术领域

本发明涉及文库构建技术领域，更具体地，涉及一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法。

背景技术

PacBio平台(PacBio核酸测序平台)采用的是单分子实时测序(Single MoleculeReal-Time)。PacBio平台的测序基于两个关键技术，第一，Pacific Biosciences公司发明的一种直径只有几十纳米的纳米孔，该纳米孔内只能容许单分子核酸在DNA聚合酶作用下进行反应，检测纳米孔中合成过程的A、T、C、G这四种荧光标记的脱氧核苷酸，即可实现核酸测序；第二，利用共聚焦显微镜实时、快速地对集成在SMRT cell上的无数的纳米孔同时进行记录。PacBio核酸测序平台，其平均读长可达10-15k，且测序不受AT和CG含量的影响，能够对高GC含量或低GC含量的区域进行测序，相比二代测序有较大优势。

但PacBio核酸测序平台仍存在一些不足，例如目前已有的扩增子扩增时，并不会添加标签引物；即使引入标签，一般也是通过两轮PCR、或添加具体标签序列的接头来实现，这些步骤相对繁琐，并且成本也较高。而在Illumina测序平台上，一般是通过添加带有标签序列的接头，或在文库构建的最后一步通过PCR加入单端的标签序列，这些操作同样存在着流程相对复杂、成本高的问题。

发明内容

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提出了一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法，该方法将带有不同标签的扩增子混合，可实现多个扩增子样品仅需一次文库构建并实现测序，简化了实验操作流程，提高了建库效率，降低了测序成本。

为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

一种适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库构建方法，包括如下步骤：

(1)设计与合成带标签的扩增引物：每个待测样本设计并合成一对扩增子的扩增引物，其中每对引物的5’端带有标签序列，每对引物的5’端标签序列反向互补且唯一无重复；每对引物的3’端为扩增子的特异性引物；

(2)扩增子样本的扩增：分别以各个样本DNA为模板、以对应的带标签的扩增引物为引物进行PCR扩增，扩增之后纯化PCR产物并确定片段的大小分布；

(3)将每个样本的DNA扩增纯化产物等摩尔量混样，混样后总量大于2μg；

(4)将混样扩增产物进行末端修复并纯化；

(5)对步骤(4)中的纯化产物与平末端接头进行连接反应；

(6)对步骤(5)获得的连接产物进行外切酶消化和纯化，得到适用于PacBio测序平台的扩增子混样测序文库。

进一步地，所述步骤(2)中PCR扩增体系为：50ng/μL的样本DNA 5μL、10μM带标签的扩增引物F 3μL、10μM带标签的扩增引物R 3μL、5X HiFi高保真缓冲液10μL、10mM dNTP混合液1.5μL、1U/μL HiFi酶1μL、无核酸酶水26.5μL。