[发明专利]重组Protein A蛋白及其高效表达和应用

说明书

本发明公开了一种重组Protein A蛋白及其高效表达和应用。所述重组Protein A的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，核酸序列为SEQ ID NO.2。本发明的重组Protein A可广泛用于免疫球蛋白亲和层析技术中。本发明还公开了一种由重组Protein A和琼脂糖凝胶相偶联而成的高产无内毒素抗体Protein A亲和填料，其可被应用于各种抗体的亲和层析技术可大大提高了产物的纯度。本发明首次使用毕赤酵母来表达Protein A重组蛋白，无细菌内毒素产生，极大地提高了Protein A的产量，显著降低生产成本，在抗体，特别是国内外巨大的单克隆抗体药物的生产上，提供巨大的经济效益。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地是一种重组Protein A和其高效表达方法及高产无内毒素抗体纯化用Protein A亲和填料和其制备方法。

背景技术

金黄色葡萄球菌蛋白 A（staphylococcus protein A，SPA）是金黄色葡萄球菌细胞壁上的一种蛋白，能够选择性地与免疫球蛋白的Fc结构域结合。它同自然界中许多细菌相同，表面表达多种与宿主免疫球蛋白、血清白蛋白、纤维蛋白原等血清蛋白具有结合活性的蛋白，并通过此介导细菌的致病性。它们是目前研究最多的免疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin (Ig)–binding proteins，IBPs)之一，IBPs是专指由细菌产生的特异结合宿主抗体的细菌免疫球蛋白结合蛋白。研究表明细菌 IBPs 的抗体结合区，均由多个序列高度同源的结构域以头尾相连组成，每个单结构域具有与分子完全相同的结合特性，形成Ig 结合功能的基本单位。

完整的SPA分子量为42kD的单链多肽，由三个部分组成，自N端开始分别为：信号肽S、Ig结合结构域和C-末端X蛋白。SPA含有五个高度同源的单结构域，自N端起分别为E、D、A、B和C，每个单结构域约含58个氨基酸残基，各结构域形成3股反向平行排列的α-螺旋空间结构，与哺乳动物IgG抗体重链中，第二及第三恒定区(CH2γ，CH3γ)间的分界面结合，以螺旋1和螺旋2与Fc的疏水作用为主，并通过两个分子之间的四对氢键得到进一步稳定。SPA还可以结合由人VHⅢ基因家族编码的Fab片段，同时还能结合除IgG外的其它类型抗体。

抗体（antibody），是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌，被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。经x线晶体衍射结构分析发现，Ig由四条多肽链组成，各肽链之间南数量不等的链间二硫键连接。Ig可形成“Y”字型结构，称为Ig单体，是构成抗体的基本单位。

天然Ig分子含有四条异源性多肽链，其中，分子量较大的两条链称为重链(heavychain，H)，而分子量较小的两条链称为轻链(Light chain，L)。重链分子量为50 000～75000，由450～550个氨基酸残基组成。重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不同，其抗原性也不同。据此，可将其分为5类(class)，即IgM、IgD、IgG、IgA和IgE，其相应的重链分别为μ链、δ链、γ链、α链和ε链。轻链分子量约为25 000，由214个氨基酸残基构成。轻链可分为两种，分别为kappa(κ)链和lambda(λ)链。