[发明专利]用于鉴别H5和H7高致病变异型禽流感病毒的冻干微芯片、试剂盒及方法

权利要求书

1.用于鉴别H5和H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的冻干微芯片，其特征在于，用于鉴别H5和H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述微芯片上；

所述荧光PCR反应体系包括：下述引物和探针：

H5亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒上游引物：

5＇- GAAATCAAACAAATTAGTCCTTGCG -3＇，

H5亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒下游引物：

5＇-GCGTACCCACTCCCCTGC-3＇，

H5亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒Taqman探针：

5＇- AAGAAAAAGAGGATTGTTTGGAG-3＇；

H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒上游引物：

5＇- GGAAAATGTCCGAGATATGTTAAGC -3＇，

H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒下游引物：

5＇- CATTTTCAATGAAACCCGCTATAGC -3＇，

H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒Taqman探针：

5＇- GACTGCGAGAGGCCT-3＇；

所述冻干微芯片的最低检测样本浓度为1×10¹ TCID₅₀/mL。

2.根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系还包括：Taq酶、反转录酶、海藻糖、Tris-Cl、dNTP、Mg²⁺。

3.根据权利要求1所述的冻干微芯片，其特征在于，所述H5亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的Taqman探针和H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的Taqman探针的5`端标记有荧光报告基团；3`端标记有荧光淬灭基团。

4.根据权利要求1或2所述的冻干微芯片，其特征在于，所述荧光PCR反应体系包括：上游引物0.4μM；下游引物0.4μM；Taqman探针0.4μM；DNA聚合酶0.5U/μL；反转录酶0.5U/μL；dNTP 0.3mM；Mg²⁺3mM；海藻糖5μM；Tris-Cl 5mM，其余为灭菌去离子水，总体积为36μL，每孔体积为1.2μL。

5.根据权利要求1或3所述的冻干微芯片，其特征在于，所述H5亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为FAM荧光报告基团；

所述H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的Taqman探针的5`端标记的荧光报告基团为ROX荧光报告基团；

所述H5亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒和H7亚型HA裂解位点插入变异型高致病性禽流感病毒的Taqman探针3`端标记的荧光淬灭基团为MGB淬灭基团。

6.根据权利要求1-3任一所述的冻干微芯片，其特征在于，所述微芯片上设置有若干个加样孔；所述荧光PCR反应体系通过冻干被固定在所述加样孔内。

7.根据权利要求6所述的冻干微芯片，其特征在于，所述微芯片上的加样孔为30个；所述微芯片的结构与PCR仪的加样板结构相适配。

8.根据权利要求1-3、7任一所述的冻干微芯片，其特征在于，所述冻干包括如下步骤：将装有所述荧光PCR反应体系的微芯片置于-80℃冷冻1h后再进行设备冻干。

9.根据权利要求8所述的冻干微芯片，其特征在于，所述设备冻干包括：预冻阶段，隔板温度下降到-55℃，预冻时保持时间为1h，然后设备进行抽真空，保持冷冻干燥1h；解析干燥阶段，再将隔板温度升至-25℃保持1h，然后将隔板温度升至37℃并保持2h，最后将隔板降至25℃并保持1h。