[发明专利]一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法

说明书

本发明公开了一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其包含以下步骤：步骤1：将斑马鱼用A1溶液进行清洗以去除杂物，然后用乙醇洗涤；步骤2：处死斑马鱼，并快速取出斑马鱼心脏；步骤3：将取出的心脏用A2溶液进行洗涤除菌；步骤4：用剪刀精细切碎心脏，用细胞培养液A3吹打成单细胞悬液；步骤5：将单细胞悬液离心后弃去细胞培养液A3，加入细胞培养液A4进行培养。本发明平均一个斑马鱼心脏能够得到约9.2×10⁵个原代心肌细胞。可进一步用于研究心脏发育与再生功能、疾病机制研究，也可以应用于筛选小分子药物。本方法效率高、经济、方便；分离的斑马鱼原代细胞具有功能性；经免疫荧光鉴定，纯度达到95％以上。

技术领域

本发明涉及细胞分离与培养技术领域，具体涉及一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法。

背景技术

心血管疾病是导致人类死亡的最主要原因之一，并且呈逐年上升趋势。心肌细胞凋亡或者生长抑制可导致心肌功能障碍，甚至机体死亡。心肌再生是目前心血管疾病研究中的热点问题。心脏组织工程研究通过永生化心肌细胞、胚胎或胎儿及新生儿的细胞模型以及诱导不同来源干细胞定向分化为心肌细胞来解决心肌细胞自我更新和再生能力有限等问题，为心肌再生提供了新的治疗策略；但是种种研究方法所产生的心肌细胞并没有成体细胞的全部功能。心肌细胞是永久分化细胞，在体外培养难度极大，目前常用的模拟心肌细胞(例如H9C2细胞)具有心肌细胞的部分活性但并非真正的心肌细胞；因此发明高效的成体心肌细胞体外培养新方法有助于解决目前心血管研究领域中真实心肌细胞难以体外培养的重大难题。

斑马鱼(Danio rerio)胚胎在体外发育且通体透明，遗传背景与人类高度同源，广泛用于发育学研究。但人类心血管疾病大部分在成体发病，因此近年来斑马鱼成体模型逐渐兴起。现阶段，胚胎斑马鱼为模型的研究主要集中在心脏发育与再生方面。在成体模型方面，由于斑马鱼体型小，心脏组织少，心肌细胞原代培养困难，限制了成体斑马鱼心血管疾病模型的应用和相关机制的研究。目前的斑马鱼原代心肌细胞分离方法效率低，得到的原代心肌细胞数量十分有限；同时，原代细胞的传代数量限制，在很大程度上限制了斑马鱼心肌细胞系的应用前景。体外心肌细胞培养方法学的构建困难，使得成体斑马鱼心肌细胞的体外研究有较大的局限性，也因此成为斑马鱼心血管疾病的成体模型的建立和研究并未得到广泛开展的重要原因之一。本发明大大提高了斑马鱼成体心脏的心肌原代培养效率和质量，突破了斑马鱼模型研究的瓶颈。

发明内容

本发明的目的是提供一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，以解决现有斑马鱼原代心肌细胞分离与培养方法的缺点与不足，为斑马鱼原代心肌细胞的研究与应用提供工具细胞。

为达到上述目的，本发明提供了一种斑马鱼原代心肌细胞分离与培养的新方法，其包含以下步骤：

步骤1：将斑马鱼用A1溶液进行清洗以去除杂物，然后用乙醇洗涤；

步骤2：处死斑马鱼，并快速取出斑马鱼心脏；

步骤3：将取出的心脏用A2溶液进行洗涤除菌；

步骤4：用剪刀精细切碎心脏，用细胞培养液A3吹打成单细胞悬液；

步骤5：将单细胞悬液离心后弃去细胞培养液A3，加入细胞培养液A4进行培养；

所述A1溶液的配制方法为：取0.17-0.37g磷酸二氢钾、1.32-1.52g磷酸氢二钠、7-9g氯化钠和0.1-0.3g氯化钾，混合后加700-900mL去离子水搅拌溶解，加入浓盐酸调pH至7-8后定容到1L，最后添加80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素；

所述A2溶液的配方为青霉素与链霉素浓度加倍的A1溶液；

所述细胞培养液A3的配方为：DMEM完全培养基、体积分数为8％-12％的胎牛血清、80-120单位/mL青霉素与80-120μg/mL链霉素；