[发明专利]一种鸟苷四磷酸的超高效液相色谱检测方法

说明书

本发明公开了属于化学分析技术领域的一种鸟苷四磷酸的超高效液相色谱检测方法。所述方法包括，采用如下色谱条件：色谱柱：反相C18色谱柱；流动相：包括流动相A与流动相B；所述流动相A为甲醇或乙腈，所述流动相B为KH₂PO₄溶液或K₂HPO₄‑KH₂PO₄缓冲液；洗脱条件为：流动相A：流动相B＝3～10：97～90。本发明的方法能有效检测到ppGpp，基线平稳，进样量少，节约时间和成本，不需设置梯度洗脱，操作简单方便，检测效果好。

技术领域

本发明涉及化学分析技术领域，具体涉及一种鸟苷四磷酸的超高效液相色谱检测方法。

背景技术

鸟苷四磷酸(ppGpp，C₁₀H₁₇N₅O₁₇P₄)分子量为603，是一种小分子核苷酸，1969年首次被报道，是细菌应对胁迫的一种重要的警卫素。大肠杆菌(Escherichia coli)处于氨基酸缺乏的环境时，体内核苷酸会发生变化，通过薄层层析技术可观察到“魔斑1”与“魔斑2”的出现，后证实分别为ppGpp与鸟苷五磷酸(pppGpp)。当细菌遇到环境胁迫时，菌体内积累(p)ppGpp，从而触发严紧反应，使得与胁迫相关的基因上调表达。在细菌菌体内，pppGpp稳定性差，可通过pppGpp磷酸水解酶(GppA)和GTP酶的催化能快速转化为ppGpp，因此本发明方法主要研究ppGpp的检测。

目前对于ppGpp的检测方法常用的为高效液相色谱法。现有文献(Ochi,Kandalaet al.1981)报道中常用高低盐溶液缓冲液进行梯度洗脱的高效液相色谱(HPLC)方法进行ppGpp的检测，具体方法为：选用阴离子交换色谱柱(Partisil SAX 10,4.6×250mm,Whatman)；Buffer A为低盐缓冲液：7mmol/L KH₂PO₄溶液，H₃PO₄调节pH至4.0；Buffer B为高盐缓冲液：0.5mol/L KH₂PO₄与Na₂SO₄溶液，KOH调节pH至5.0；洗脱条件为Buffer B在20min内从0％(v/v)升到100％(v/v)，然后100％维持20min，最后5min从100％降到0％；流速为1mL/min；进样量为90μL。上述检测方法存在的缺点是：基线漂移，积分不准确；且缓冲液均为盐溶液，易损伤色谱柱与仪器；出峰时间为45min，耗时长；需设置梯度洗脱，操作复杂。

超高效液相色谱仪简称UHPLC，超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别，UHPLC借助于HPLC(高效液相色法)的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术。目前尚未有利用UHPLC检测ppGpp方法的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的问题，为了提高鸟苷四磷酸的检出率、积分的准确性；节约成本、简化操作，提供一种需时较短、分离效果更好、积分更准确、更简便的鸟苷四磷酸的超高效液相色谱检测方法。

为此，本发明的技术方案为：

一种鸟苷四磷酸的超高效液相色谱检测方法，包括如下步骤，采用如下色谱条件：

色谱柱：反相C18色谱柱；

流动相：包括流动相A与流动相B；

所述流动相A为甲醇或乙腈，所述流动相B为KH₂PO₄溶液或K₂HPO₄-KH₂PO₄缓冲液；

洗脱条件为：流动相A：流动相B＝3-10：90-97。