[发明专利]一种同时表达HA和HEF的复制缺陷型重组流感病毒

权利要求书

1.一种复制缺陷型重组流感病毒的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下的步骤：

1）合成包含有D型流感病毒表面糖蛋白-血凝素酯酶融合蛋白HEF的开放阅读框、A型H1N1流感病毒NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的DNA片段，将合成的DNA片段连接到载体质粒pHW2000上，构建成重组质粒pHW-NA-HEF；其中D型流感病毒表面糖蛋白-血凝素酯酶融合蛋白HEF的开放阅读框插入到A型流感病毒H1N1 NA片段3′端非编码区的202个核苷酸和5′端非编码区的185个核苷酸的包装信号之间；形成的元件顺序为 202nt NA-HEF ORF-185nt NA；

2）将步骤1）构建的重组质粒pHW-NA-HEF与用于表达A型流感病毒亚型H1N1的PB2、PB1、PA、HA、NP、M、NS七个基因序列的质粒共同转染到293T细胞和稳定表达流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞；

3）收集转染后293T细胞和MDCK细胞的上清培养液；

4）在稳定表达A型流感病毒H1N1亚型神经氨酸酶NA的MDCK细胞系上扩增拯救出的重组流感病毒CA09-HEF。

2.一种重组病毒株，其特征在于，所述的重组病毒株是用权利要求1所述的方法构建的。

3.权利要求2所述的重组病毒株在制备疫苗中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的疫苗，为弱毒活疫苗。

5.一种弱毒活疫苗，其特征在于，所述的疫苗，其中抗原包含有权利要求2所述的重组病毒株。

6.权利要求3中 所述的重组病毒株在制备中和抗体中的应用。