[发明专利]水稻基因OsZIP4的基因工程应用

权利要求书

1.水稻基因OsZIP4的基因工程应用，所述的水稻基因OsZIP4在Genbank的登录号为Os08g10630；所述的应用为所述水稻基因OsZIP4在调节水稻提前分蘖、提高有效分蘖数中的应用以及所述水稻基因OsZIP4在缩短生长周期和提高产量中的应用。

2.根据权利要求1所述的基因工程应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)总RNA的提取：水稻在1/2强度的Kimura B营养液中培养，称取适量的根，用液氮充分研磨，使用植物RNA提取试剂盒提取根中的总RNA；

(2)基因OsZIP4的CDS片段的克隆：以步骤(1)得到的总RNA为模板，利用反转录试剂盒对RNA样品进行反转录合成cDNA；利用NCBI网站的基因数据库检索到水稻基因OsZIP4的核苷酸序列，利用基因OsZIP4的CDS序列设计引物，其中上游引物的5’端添加attB1位点序列，下游引物5’端添加attB2位点序列：

OsZIP4-F:5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTATGGACGCCATGAGGCAGAGCACGC-3’；

OsZIP4-R:5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTGCGTGCTCTGCCTCATGGCGTCCAT-3’；

以cDNA为模板，以OsZIP4-F/OsZIP4-R为引物，利用高保真酶进行PCR扩增，PCR程序如下：(1)94℃预变性2min；(2)94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；(3)72℃5min；扩增的PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分离后使用凝胶回收试剂盒进行切胶回收，得到基因OsZIP4的CDS片段；

(3)超表达载体pGWB2-OsZIP4的构建：将步骤(2)得到的基因OsZIP4的CDS片段通过BP反应连接到入门载体pDONR221上，然后通过LR反应将基因OsZIP4的CDS片段连接到植物表达载体pGWB2上，得到超表达载体pGWB2-OsZIP4，将超表达载体pGWB2-OsZIP4转化至感受态大肠杆菌DH5α中，然后进行菌落PCR鉴定，扩增阳性菌落并提取超表达载体pGWB2-OsZIP4备用；

(4)转基因植株的获得：将步骤(3)获得的超表达载体pGWB2-OsZIP4转化到农杆菌再侵染至水稻的愈伤组织中，共培养，经过清洗、选择培养、分化、生根、炼苗得到T₀代转基因植株；对所有的转基因材料进行两次扩繁，得到稳定遗传的T₁代和T₂代材料。

3.根据权利要求2所述的基因工程应用，其特征在于，步骤(4)中所述超表达载体pGWB2-OsZIP4的转化方法为农杆菌介导法。