[发明专利]一种采用发酵的方法制备几丁质的方法

权利要求书

1.一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于包括如下步骤：

1)一个菌种活化的步骤：将保藏的菌种于无菌操作下转接于斜面培养基中，放置于恒温恒湿培养箱中28℃培养5-7天；所述的菌种为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，所述的菌种的保藏号为CGMCC No.15668；

2)一个种子培养的步骤：将步骤1)中的斜面菌种于无菌操作下，刮取黄色孢子并转移至无菌生理盐水中，调整孢子浓度为4.0-7.0×10⁸个孢子/ml，后按照10％的接种量转接于已经灭菌的种子培养基中，于恒温摇床中进行培养，培养条件为：28℃，转速180rpm，培养时间24h；

3)一个发酵培养的步骤：先在发酵培养基中加入过氧化氢溶液，每升培养基加入0.1-1.5ml的过氧化氢溶液，并搅拌均匀，后再将步骤2)中获得的种子培养液无菌操作下按照10％的接种量转接于发酵培养基中，于恒温摇床或发酵罐中进行培养，恒温摇床培养条件为：24-30℃，转速140-200rpm，培养时间36-48h；发酵罐培养条件为：24-30℃，转速100～450rpm，通气量0.4～1.6v/v/min，培养时间24-40h；

4)一个获取菌体的步骤：将步骤3)中所获得的发酵液，用抽滤装置进行抽滤，取滤渣，并用纯化水对滤渣进行洗涤，洗至滤液pH中性且无色为止，获得湿菌体，再将湿菌体放置于烘箱中50-90℃烘干至恒重，获得干菌体，对干菌体进行粉碎，获得平均粒度小于40目的菌体粉末；

5)一个对几丁质进行分离提取的步骤：

①「一个酸处理的步骤：将步骤4)中获得的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，加入0.1-1.0mol/L的盐酸溶液进行处理，加入后的固液比1:10-1:30，处理温度4-40℃，间隔4-8h进行间歇搅拌，搅拌转速100rpm，处理12-36h，然后抽滤去除酸液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；

②「一个碱处理的步骤：将前述酸处理后的菌体粉末放置于带有夹套可控制温度的反应容器中，用含有乙醇和氢氧化钠的水溶液继续处理，在上述的水溶液中，乙醇的质量百分比浓度为5％-15％，氢氧化钠的质量百分比浓度为2％-10％，加入后的固液比1:10-1:30，处理温度4-40℃，间隔4-8h进行间歇搅拌，搅拌转速100rpm,处理12-36h，然后抽滤去除碱液，用纯化水清洗菌体粉末至pH中性；

③「一个进行干燥的步骤：将上述进行酸碱处理后的菌体粉末于烘箱中45-80℃烘干24-48h，得到的白色粉末即为几丁质。

2.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：在步骤1)中所用斜面培养基中，每升培养基中含有200g的去皮马铃薯，20g的葡萄糖，20g的琼脂，pH6.4-6.6；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。

3.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：在步骤2)的种子培养基中，每升培养基中含有8g的蔗糖，8g的酵母膏，2.0g的糖蜜，pH6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。

4.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：在步骤3)中的发酵培养基中，每升培养基中含有20-40g的蔗糖，10-30g的酵母膏，3-10g的黄豆粉，0.5-2.0g的糖蜜，1.0-2.0g的K₂HPO₄，1.0-3.0g的MgSO₄·7H₂O，0.005-0.02g的FeSO₄·7H₂O，1.0-2.0g的NaH₂PO₄·12H₂O，pH 5.0-6.0；上述的培养基均在121℃，湿热灭菌30min，冷却后使用。

5.如权利要求1所述的一种采用发酵的方法制备几丁质的方法，其特征在于：步骤3)中所述过氧化氢溶液的质量百分比浓度为20％。

6.一种菌株，其特征在于，其分类命名为赭曲霉(Aspergillus ochraceus)，保藏号为CGMCC No.15668。