[发明专利]一种单细胞多巴胺受体亚型mRNA表达的巢式PCR检测方法

说明书

本发明公开了一种单细胞多巴胺受体(Dopamine Receptor,DAR)亚型mRNA表达的巢式PCR检测方法。该方法针对DAR的5种亚型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分别设计两轮PCR引物，通过巢式PCR进行两轮扩增，实现了单个细胞DAR亚型的鉴定。同时，通过对内参基因(β‑actin)的检测来判断所抽提的核酸质量。因此，该检测方法结果可信，灵敏度高，能够对单个细胞内DAR的5种亚型mRNA的表达同时进行定性检测，适用于神经递质调控机制研究。

技术领域

本发明具体属于分子生物学技术领域，特别涉及一种单细胞多巴胺受体亚型mRNA表达的巢式PCR检测方法。该方法适用于对单个细胞的DAR基因表达情况进行分型检测，进而分析不同亚型的DAR在神经递质传导中的作用，探究神经元调控机制。

背景技术

多巴胺(Dopamine，DA)是神经系统中一类重要的儿茶酚胺类神经递质，参与中枢神经系统多种生理活动的调控，如摄食、运动、内分泌、情感发生等过程。DA对神经元的调控作用主要依赖于神经元表面的DAR。DAR是一类由七个跨膜结构域组成的G蛋白偶联受体，大约有400个氨基酸构成。DAR有多种亚型且广泛分布于基底神经节的诸多核团，目前在小鼠神经系统中已分离鉴定出5种DAR，即Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5。根据其生物化学和药理学性质，可将DAR分为D1类受体和D2类受体两大家族。其中，D1类受体包括Drd1和Drd5受体两种亚型，D2类受体则包括Drd2、Drd3和Drd4三种亚型。随着研究的不断深入，人们发现两类受体对DA信号呈现出相反的应答作用。D1类受体与兴奋性G蛋白(Gs)相偶联，D1类受体激活后会升高细胞内第二信使cAMP的生成，从而传递兴奋性信号，以激活突触后神经元。而D2类受体与抑制性G蛋白(Gi)偶联，激活后则会降低细胞内cAMP的水平，传递抑制性信号。DA对生理活动的调控正是通过两类受体的协作完成的。如DA对纹状体中型棘突神经元(medium spiny neurons，MSN)的兴奋性和GABA神经递质的释放与DAR类型密切相关。上游DA信号能够通过黑质纹状体直接通路激活表达Drd1的MSN，而通过间接通路抑制表达Drd2的MSN。基于此，针对主要神经元DAR亚型的鉴别与分布，特别是单细胞水平上的鉴定，已成为神经科学领域的研究热点。

目前，DAR亚型测定的方法主要有：依赖抗体的免疫印迹、荧光原位杂交(FISH)和聚合酶链式反应(PCR)的基因表达检测。应用特异的多巴胺配体化合物很容易将Dl类受体和D2类受体家族区分开来，但大多数化合物不能区分同一家族受体的亚型。由于缺乏性能良好的抗体，针对蛋白质表达的免疫印迹方法对DAR亚型的检测也受到限制。因此，目前DAR亚型基因表达检测常用的方法有FISH和PCR。

其中，FISH只能在固相切片上，对组织的某一功能区域或核团进行原位检测。神经组织核团结构复杂，功能多样，神经环路机制研究工作常需要在保持细胞活性的状态下，对单个神经元进行功能检测及DAR基因表达检测。FISH无法在此情况下对这种单个神经元DAR类型进行区分鉴别。PCR技术是实验室常用的一种分子生物学检测技术，操作简便，灵敏度高，结果稳定。使用特定的单细胞捕获与操作技术分离单个神经元，提取单细胞核酸后，可以利用PCR技术进行DAR亚型mRNA的表达检测。巢式PCR检测技术使用特定的引物进行两轮PCR扩增，检测极限能够到达pg级别，可以满足以单个细胞核酸为模板，对目标基因进行定性或定量检测。

目前，常用的单细胞捕获与操作的技术有毛细管采集技术、激光捕获显微切割技术(laser capture microdissection，LCM)以及荧光活化细胞流式细胞仪分选技术(fluorescence-activated cell sorting，FACS)等实验方法。其中，膜片钳(voltageclamp)技术能够测量细胞膜上单个离子通道的电流信息，在细胞电生理检测中有着广泛的应用。同时，膜片钳技术正是基于毛细管采集技术，在显微镜下实现了对单个细胞的分离、操控以及核酸物质的抽提。因此，将膜片钳与单细胞PCR技术相结合，不仅能检测细胞的电生理特征，同时能满足基因表达检测，因此在神经生物学领域内有着巨大的应用前景。

发明内容