[发明专利]一种用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物及其试剂盒

说明书

本发明公开了一组用于检测人类EGFR基因突变的引物序列和blocker序列，涉及EGFR基因突变的检测。本发明还进一步公开了包括该引物序列和blocker序列的试剂盒及使用方法。本发明提供的检测人类EGFR基因突变引物序列和blocker序列可在单一反应中检测多种不同类型的突变基因，灵敏度高，特异性强，单次检测通量高。

技术领域

本发明涉及一种人类基因突变的检测方法，尤其涉及一种用于检测人类EGFR基因突变的序列组合物及其试剂盒和方法。

背景技术

人类表皮生长因子(epidermal growth factor receptor，EGFR)是一种蛋白酪氨酸激酶受体，广泛分布于哺乳动物上皮细胞、成纤维细胞、胶质细胞等细胞表面，具有酪氨酸激酶活性。EGFR是HER/ErbB家族成员之一。EGFR与其配体结合后在细胞表面形成二聚体，通过酪氨酸激酶的活性，激活受体自磷酸化，经过细胞质中的衔接蛋白和酶的级联反应，调节转录因子激活基因的转录，指导细胞迁移、增值、分化和凋亡。当EGFR发生突变时，EGFR自身或配体过表达，从而通过自分泌或旁分泌方式刺激细胞形成失控性增值。此外，EGFR过度活化还可以启动多种蛋白水解和促血管生成因子的表达，从而加速癌细胞的转移。因此，EGFR过表达者通常预后较差。

易瑞沙和特罗凯作为EGFR受体酪氨酸激酶抑制剂，是美国FDA批准用于NSCLC靶向治疗的主要药物。但是临床实验表明易瑞沙和特罗凯仅对10-30％的NSCLC病人有显著的疗效。进一步的研究发现EGFR基因突变与NSCLC靶向治疗疗效相关，多数携带EGFR基因突变的患者疗效显著。肺癌细胞中有EGFR酪氨酸激酶基因编码区18-21外显子突变的患者，靶向药物吉非替尼的有效率高达80％。如果病人不携带有EGFR基因突变而服用此类药物，不仅会耽误病情还会造成巨额的药疗资源的浪费。因此，检测组织或血液中是否含有EGFR基因突变对于指导NSCLC病人临床用药，具有重要的参考价值，也是未来肿瘤个体化治疗的发展方向。

EGFR突变为体细胞突变，在肿瘤患者中突变的频率较高(美国NSCLC患者中约10％有EGFR基因突变，而亚洲人群这一比例约为30％)。但是突变基因与未发生突变的野生型基因相比，突变比例极低，根据不同肿瘤分期，这一比例通常为0.01％～10％。因此针对EGFR突变基因的检测最大的难题是如何在大量野生型基因背景下检测出极少量发生突变的EGFR基因。另外，由于已知与靶向治疗有关的EGFR突变类型高达40多种，因此如何实现有效检测40多种突变类型是另一项挑战。表1介绍了人类肿瘤患者中EGFR突变常见的42中突变亚型。

表1：肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因的42种突变亚型

目前检测基因突变的方法主要包括：直接测序法、传统的荧光定量PCR法和探针扩增阻滞突变法(amplification refractory mutation system,ARMS)(申请号CN101608240B/CN102747157A)。直接测序法耗时长且灵敏度低，只能对含量超过5％的基因突变进行检测，通常只能用于实验室的科研，难以用于临床的检测。传统的荧光定量PCR法难以使突变型基因在大量的野生型基因中得到专一性的扩增，容易出现假阳性的检测结果；同时检测的位点数量和检测样本的通量都相对比较小。ARMS-PCR法是利用PCR引物的3’末端碱基必须与模板完全互补才能有效扩增的原理，通过设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，进而达到检测突变基因的目的。虽然ARMS-PCR方法是一种较为简单、且灵敏度较高的检测方法，但是受限于PCR检测通道，难以实现对多种EGFR突变基因进行同时检测。

因此，为了同时解决现有EGFR突变基因检测技术所面临的灵敏度和检测通量低的问题，本发明致力于开发出一种EGFR基因突变的引物组、blocker组及其在modified-ARMsPCR的使用方法。该方法应具有灵敏度高、准确性高、特异性强和单次检测通量高，且能同时检测出多种突变基因的优点。因此，本领域的技术人员致力于开发一种

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