[发明专利]HRVVP7转基因红花种子的培育方法

权利要求书

1.HRVVP7转基因红花种子的培育方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将构建的pPhaP3301-HRVVP7植物表达载体质粒冻融法转化农杆菌感受态细胞EHA105；

S2、通过农杆菌侵染法，将HRVVP7目的基因转入红花子叶中，利用组织培养技术，草铵膦筛选获得转基因红花苗；

S3、以红花实生苗为砧木，劈接法嫁接转基因红花苗，对成活植株进行PCR验证，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。

2.如权利要求1所述的HRVVP7转基因红花种子的培育方法，其特征在于，所述步骤S2具体包括如下步骤：

(1)种子培养

A.选取籽粒饱满的红花种子置于灭过菌的三角瓶中，加入0.5％升汞浸泡消毒10min，无菌条件下弃掉升汞，无菌水清洗5次，每次5min；

B.消毒后的种子置于种子培养基中，每个培养皿播种20粒红花种子，每次播种20个培养皿；

C.培养皿封口后置于培养箱中25℃暗培养3天，观察红花出芽情况；

(2)侵染及共培养

A.种子萌发生长出两片子叶后，观察有无染菌情况，如果种子有染菌情况，在培养皿对应位置做好标记；

B.在无菌条件开启培养皿，75％酒精棉球迅速覆盖染菌区域；

C.用无菌刀片沿红花子叶生长点处切开，弃掉下胚轴，子叶置于含有pPhaP3301-HRVVP7的OD＝0.6-0.8的农杆菌溶液中，侵染10min，侵染期间摇晃三角瓶使菌液与子叶切口充分接触增加侵染几率；

D.侵染完毕后，无菌镊子夹取子叶置于无菌滤纸上吸去多余菌液，置于共培养基上，子叶切口接触培养基，25℃暗培养3天；

(3)丛生芽分化培养

无菌条件下将暗培养3天的红花子叶转移至抑菌培养基内，每个培养皿置6个子叶，光照16h，黑暗8h，培养4周；

(4)丛生芽伸长及草铵膦筛选

A.待丛生芽长出芽点后，挑选生长健壮的丛生芽，切除子叶外植体并移至伸长培养基内，光照16h，黑暗8h，培养1周；

B.伸长培养1周的丛生芽移至0.1％(w/v)草铵膦伸长培养基中，继续培养1周，观察再生苗生长情况，无发黄现象的丛生苗，经PCR检测后，呈阳性的视为转基因苗。

3.如权利要求1所述的HRVVP7转基因红花种子的培育方法，其特征在于，所述步骤S3具体包括如下步骤：

(1)砧木

A.腐殖土和蛭石按3∶1比例混合均匀置于培养钵中，浇水至湿润；

B.红花种子；播种于培养钵内，每钵两粒，置于人工气候室内21℃生长20天；

C.挑选长势健壮具有6-8片真叶的红花植株，在两片真叶上5cm处水平切除顶端，继而纵切3mm，作为嫁接砧木；

(2)接穗

再生抗性小苗主茎生长至3cm时，用刀片削成V字型，切削动作避免反复；

(3)嫁接

A.将接穗插入砧木切口中，封口膜紧密缠绕固定；

B.保鲜膜密封膜罩住嫁接的小苗以保持高的湿度，人工气候室光照16h，黑暗8h，21℃生长1周；

C.当嫁接苗生长出2-3片新叶时，在7天时间内，逐步打开保鲜膜进行炼苗，待嫁接苗完全适应外界环境时去掉保鲜膜；

(4)转基因植株的基因组PCR鉴定，阳性植株收获种子后继续扩繁；收获T3代稳定遗传的转基因红花种子。