[发明专利]一种具有单碱基分辨率的检测DNA甲基化和单核苷酸变异的测序文库及应用

说明书

本发明提供了一种发夹状的接头以及利用所述发夹状接头同时检测DNA甲基化和单核苷酸变异的方法，属于基因变异检测和表观遗传修饰检测技术领域；所述接头具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述发夹状接头的5’至3’方向3位和4位上的胞嘧啶是甲基化修饰的胞嘧啶。所述方法包括以下步骤：基因组DNA片段化后进行末端修复加A尾，连接所述的发夹状接头和甲基化测序接头，重亚硫酸盐转化，PCR扩增，收集扩增产物获得测序文库；测序后进行生物信息学分析获得DNA甲基化和单核苷酸变异位点，本方法可以在只测一套数据的情况下同时精确检测DNA甲基化和单核苷酸变异，可以节省50％的成本。

技术领域

本发明属于基因变异检测和表观遗传修饰检测技术领域，尤其涉及一种具有单碱基分辨率的同时检测DNA甲基化和单核苷酸变异的方法。

背景技术

胞嘧啶甲基化是基因组DNA上丰度最高、研究最广泛的表观遗传修饰，其在很多生物学过程中发挥了重要的作用，包括胚胎发育、X染色体沉默、基因印记和转座元件沉默等。胞嘧啶甲基化的紊乱在癌症、免疫缺陷等众多疾病的发生和发展过程中发生。目前，全基因组范围、单碱基分辨率的DNA甲基化检测主要通过重亚硫酸盐处理结合高通量测序实现，在此过程中未甲基化的胞嘧啶被转化为尿嘧啶，随后在扩增时被胸腺嘧啶取代，而甲基化胞嘧啶则不发生转化。

从重亚硫酸盐测序数据中鉴定单核苷酸变异对于准确定量DNA的甲基化水平尤为重要，尤其是因为CT突变是人群中最广泛的变异(dbSNP数据库中65％的的SNP是CT)，并且经常发生在CpG上。鉴定单核苷酸变异对于检测等位基因特异的DNA甲基化位点和印记基因也有重要意义。

同时检测胞嘧啶甲基化和单核苷酸变异一直备受关注，针对这一课题，目前已有多款软件用来从MethylC-seq数据中检测单核苷酸变异。这些软件的共同原理都是基于未甲基化的胞嘧啶在重亚硫酸盐处理时被转化为尿嘧啶，而与胞嘧啶互补配对的鸟嘌呤不发生变化。尽管目前已有多款软件用来从MethylC-seq数据中检测单核苷酸变异，但是由于MethylC-seq文库本身的缺陷，软件的灵敏性和准确性都较低。主要是因为在MethylC-seq文库构建过程中，经过重亚硫酸盐处理后DNA的双链会分开，因此在后面测序的时候可能只测到其中一条链，造成无法判断该位置是未甲基化的胞嘧啶还是胞嘧啶胸腺嘧啶的单碱基突变。另外，由于在重亚硫酸盐处理过程中，绝大多数胞嘧啶未发生甲基化而被转化成尿嘧啶，因此重亚硫酸盐转化后的基因组碱基和序列复杂度降低，这导致了后续生物信息分析过程中比对错误率极高。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种具有单碱基分辨率的同时检测DNA甲基化和单核苷酸变异的方法，所述方法灵敏度和准确度高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：一种发夹状的接头，所述发夹状接头具有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，所述发夹状接头的5’至3’方向3位和4位上的胞嘧啶是甲基化修饰的胞嘧啶。

本发明还提供了一种具有单碱基分辨率的同时检测基因组DNA甲基化和单核苷酸变异测序文库的构建方法，包括以下步骤：1)将基因组DNA进行片段化获得DNA片段；2)将步骤1)中获得的DNA片段进行末端修复加A尾后，同时连接发夹状接头和甲基化测序接头，获得待转化的DNA片段；3)将所述待转化的DNA片段重亚硫酸盐转化后，进行PCR扩增，切胶纯化扩增产物获得测序文库。

优选的，所述DNA片段的长度为150～200bp。

优选的，步骤2)中所述末端修复加A尾的体系中包括DNA片段、末端修复加A缓冲液和末端修复加A缓冲液混合酶。

优选的，所述末端修复加A尾的程序为20℃，30min，65℃，30min。

优选的，步骤3)中构建获得的测序文库的片段大小为400～800bp。