[发明专利]一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法

说明书

本发明公开了一种高效表达糖苷内切酶Endo S及其突变体的方法，属于发酵工程技术领域。本发明的方法为使用成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基对可产糖苷内切酶Endo S及其突变体的菌株进行发酵；本发明的方法可成功将糖苷内切酶Endo S的产量提高至225mg/L。

技术领域

本发明涉及一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，属于发酵工程技术领域。

背景技术

Endo S(EC 3.2.1.96)是一种来源于化脓链球菌的β-N-乙酰葡萄糖苷内切酶，属于糖苷水解酶GH18家族，其主要的生物学功能是特异性水解免疫球蛋白G(IgG)可结晶区(Fc片段)N糖链，作用位点为N糖链核心五糖中两个N-乙酰葡萄糖胺之间的苷键。

由于IgG抗体糖基化修饰影响抗体介导的细胞毒性作用(ADCC)及补体依赖的细胞毒性作用等一系列免疫反应，Endo S逐步被开发应用于自身免疫疾病治疗和抗体糖基修饰功能化改造。

随着Endo S应用的增多，市场上对其需求量也越来越大，但是，目前，关于提高Endo S产量方面的研究依旧十分少，已有的研究所展示出的成果也不尽如人意，这一定程度上限制了Endo S的应用。

例如，2001年，Mattias Collin等先第一次利用pET30a载体克隆了完整的Endo S基因，并在BL21(DE3)pLys中成功表达，随后又利用载体pGEX表达了与谷胱甘肽转移酶(GST)标签融合表达的Endo S，纯化后并把GST标签切除得到Endo S纯蛋白，但是，其产量微乎其微；2012年，Wei Huang等报道，在25℃下，使用添加了0.1mM IPTG的LB培养基发酵培养Mattias Collin课题组的BL21(DE3)-pGEX-GST-Endo S重组菌，16h后蛋白产量为40mg/L，此产量仍旧不能满足工业生产的需求；Goodfellow等以pGEX-4T-1为载体，BL21(DE3)为宿主表达了密码子优化后的GST-Endo S，但是，其产量仅为10mg/L发酵液；2013年，Trastoy等人在C端融合霍乱弧菌MARTX毒素半胱氨酸蛋白酶结构域(his6-CPD)的载体pCPD上表达Endo S，宿主同样为BL21(DE3)，通过镍柱纯化，肌醇六磷酸处理最后得到Endo S蛋白，其产量也微乎其微。

因此，我们急需找到一种可提高Endo S产量的方法以满足市场需求。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法。此方法为使用成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基对可产糖苷内切酶Endo S或其突变体的菌株进行发酵；此方法可成功将糖苷内切酶Endo S的产量提高至225mg/L。

本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种高效表达糖苷内切酶Endo S或其突变体的方法，所述方法为使用成分包含8～15g/L的酵母粉、2～10g/L的甘油、20～30g/L的牛肉浸膏、2～10g/L的NaCl的发酵培养基进行发酵；所述发酵所使用的生产菌株为可产糖苷内切酶Endo S或其突变体的菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的成分包含10.0g/L的酵母粉4.0g/L的甘油、25.4g/L的牛肉浸膏、5.0g/L的NaCl。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为5～9。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵培养基的pH为8.0。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度16～37℃、时间4～48h。

在本发明的一种实施方式中，所述发酵的条件为温度20℃、时间24h。