[发明专利]靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用

说明书

本发明涉及一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂‑聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用，该疫苗佐剂在疏水性内核包载TLR7激动剂，在磷脂层包载TLR4激动剂，通过磷脂层中的阳离子磷脂吸附抗原，同时甘露糖配体的连接使其具有特异性靶向抗原提呈细胞树突状细胞的能力，从而增强对DC细胞的摄取和促成熟效果；通过杂化纳米粒保护抗原并提高DC细胞对抗原的摄取，通过TLR激动剂显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递，产生强有力的T细胞杀伤效应，诱导细胞因子分泌，产生长效记忆性T细胞反应，对肿瘤有较好的预防能力。

技术领域

本发明涉及疫苗佐剂技术领域，具体涉及一种靶向共载抗原和TLR激动剂的阳离子磷脂-聚合物杂化纳米粒疫苗佐剂及制备方法与应用。

背景技术

免疫治疗是继手术治疗、治疗和放射治疗后的又一种新型疗法。免疫治疗的作用方式有三种：1)设计单克隆抗体以增强免疫反应进而杀伤癌细胞；2)使用免疫检查点抑制剂来帮助免疫系统识别和攻击肿瘤细胞，如PDL-1、CTAL-4等；3)合成疫苗引发免疫反应来治疗和预防肿瘤。与直接用药物杀死肿瘤细胞的化学疗法不同，免疫疗法是通过激活或重建病人免疫系统并改变肿瘤微环境，使机体对肿瘤细胞重新产生识别和杀伤能力的一种治疗方法。这种治疗方法对机体正常细胞不产生损坏作用，却能抑制肿瘤的复发和转移，并且由于记忆功能的存在而具有长期免疫的效果，因此受到了广泛关注。

疫苗是通过模仿机体被侵染的过程来激活免疫细胞应答的。疫苗被注射到机体后，固有免疫细胞表面上的模式识别受体(pattern recognition receptors,PRRs)与疫苗的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs)在注射部位结合，从而上调趋化因子和细胞因子等一系列免疫反应。注射部位的APC数目随之增加，随后通过对抗原的结合、摄取、处理等过程将抗原信息传递给T细胞。B细胞受到辅助性T细胞的活化后分泌抗体。最终，部分T、B细胞分化为记忆细胞为下次侵染做准备。

一些成功的疫苗如黄热病疫苗(YF-17D)的研究表明，经由多种Toll样受体(Tolllike receptors,TLRs)有效地激活DCs并增加促炎因子的分泌可以达到免疫系统的有效应答。TLRs是先天性免疫的主要传感器，可以激活一系列的免疫细胞。根据TLRs位置将其细分为两种类型：细胞膜相关受体(TLRs 1,2,4,5和6)，主要识别细菌细胞壁成分和内体相关受体(TLRs 3,4,7,8和9)，它们对细菌或病毒核酸特别敏感。已有研究表明使用TLR激动剂作为佐剂能显著增强抗原刺激后的免疫应答并显著改善抗原交叉呈递。最近，对疫苗递送的进一步研究表明了通过组合多个TLRs触发不同信号传导途径以激活协同免疫应答的重要性。单磷酰磷脂A(Monophosphoryl lipid A,MPLA)(位于细胞膜上和内体上的TLR4激动剂)能够诱导强烈的Th1-极化免疫应答，同时能够显著降低LPS的毒性100-10,000倍。作为第一个被批准作为佐剂使用的TLR激动剂，MPLA已成功用于治疗宫颈癌肝炎和疟疾(RTS,)等商业疫苗。咪喹莫特(imiquimod,IMQ)是TLR7的激动剂，是一种很有前景的DCs激活剂，已被FDA批准为免疫调节剂。IMQ的局部给药在几种皮肤病的治疗中已经显示出了有效性。(IMQ 5％乳膏)已被批准用于治疗浅表性基底细胞癌，光化性角化病和HPV介导的外生殖器和肛周疣。

目前，核酸疫苗、蛋白疫苗、亚单位疫苗等疫苗种类的免疫原性较弱，使得疫苗的应用受到了限制同时也应运而生了佐剂的生成和发展。然而，现在批准的佐剂比如铝佐剂等只能有效激活体液免疫而无法活化细胞免疫应答，使得佐剂难以应用于癌症、乙肝、HIV等疾病。同时佐剂的安全性、与抗原的耐受性、大规模生产和制备以及商业价值等也使得疫苗佐剂很少在商业中使用。然而，游离的TLR激动剂在体内容易快速降解和清除，因此妨碍其作为疫苗佐剂的临床表现。同时，游离状态的蛋白质或肽抗原经常被迅速清除且免疫原性较差，因此只能产生短暂和较弱的免疫应答。