[发明专利]一种免标记荧光检测铅离子的方法及检测试剂盒有效

申请号：	201810857689.8	申请日：	2018-07-31
公开（公告）号：	CN109055492B	公开（公告）日：	2022-02-22
发明（设计）人：	陈俊华;潘家峰;李琼;周丹华;潘苏红	申请（专利权）人：	广东省生态环境技术研究所
主分类号：	C12Q1/6809	分类号：	C12Q1/6809;C12Q1/6811
代理公司：	广州嘉权专利商标事务所有限公司 44205	代理人：	胡辉
地址：	510650 ***	国省代码：	广东;44
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摘要：
搜索关键词：	一种标记荧光检测离子方法试剂盒
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【权利要求书】：

1.一种免标记荧光检测铅离子的检测试剂盒，其特征在于，包括铅离子特异性DNA酶序列8-17 DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲溶液、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III，其中铅离子特异性DNA酶序列8-17 DNAzyme由底物链S-DNA和催化链E-DNA共同组成，底物链S-DNA和催化链E-DNA的3'端还连接有数个保护性碱基，发夹探针HP1从5'端开始依次为A、B、C、D、E、F、G区域，其中A为5'端凸起；C区和E区互补，B区和F区除了一个C-C碱基错配外其余部分互补，且C-C错配的位置不在两端，B、C、E、F共同形成茎环结构的茎；D形成茎环结构的环；G为3'端凸起;

发夹探针HP1的序列如下所示：

HP1: 5'-CATC-CGCC-GGAAGAGATG-AAAA-CATCTCTTCC-GCCG-TCTTCC-3'；

底物链S-DNA的序列如下所示：

S-DNA: 5'-ACTCACTATrAGGAAGAGATGTTTTTT-3'；

催化链E-DNA的序列如下所示：

E-DNA: 5'-CATCTCTTCTCCGAGCCGGTCGAAATAGTGAGTTTTTT-3'。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于：缓冲溶液包括Tris-Ac缓冲溶液，pH=7.0-7.5。

3.一种免标记荧光检测铅离子的方法，其特征在于，包括下列步骤：

在室温条件下，将S-DNA和E-DNA按照1:1-1:10的浓度比混合，加入到缓冲溶液中，孵育1.5-2.5 h，得到8-17 DNAzyme；

将浓度为1-10μM的发夹探针HP1和5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺按照1:1-10:1的浓度比混合在缓冲溶液中，95℃加热5-10分钟；随后缓慢冷却至室温；

将20 uL待测溶液加入在含有8-17 DNAzyme、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺/HP1和30U Exo III 的180 uL Tris-Ac缓冲溶液，室温反应85-95分钟；然后检测λ_ex= 356 nm以及λ_em= 408 nm的荧光强度，分析待检测溶液中的铅离子情况；

其中，铅离子特异性DNA酶序列8-17 DNAzyme、发夹探针HP1、缓冲溶液、5,6,7-三甲基-1,8-萘啶-2-胺和核酸外切酶Exo III如权利要求2所述。