[发明专利]一种玉米秸秆腐熟剂及其制备方法

权利要求书

1.一种玉米秸秆腐熟剂，其特征在于，所述玉米秸秆腐熟剂由复合菌剂发酵粉碎后的玉米芯所得，所述复合菌剂包括枯草芽孢杆菌、黑曲霉菌和纤维素链霉菌，使腐熟剂的有效活菌数：枯草芽孢杆菌5～10亿个/g、黑曲霉菌5～10亿个/g和纤维素链霉菌5～10亿个/g。

2.根据权利要求1所述的一种玉米秸秆腐熟剂，其特征在于，所述复合菌剂包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌30～50份、黑曲霉菌15～25份、纤维素链霉菌25～45份。

3.根据权利要求2所述的一种玉米秸秆腐熟剂，其特征在于，所述复合菌剂包括以下重量份的组分：枯草芽孢杆菌40份、黑曲霉菌20份、纤维素链霉菌35份。

4.根据权利要求1或2所述的一种玉米秸秆腐熟剂，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌和纤维素链霉菌均购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，所述枯草芽孢杆菌的保藏编号为ACCC No.01873，所述纤维素链霉菌的保藏编号为ACCC No.40131；所述黑曲霉菌购自北京北纳创联生物技术研究院，黑曲霉菌的保藏编号为BNCC212433。

5.一种玉米秸秆腐熟剂的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)枯草芽孢杆菌发酵物的制备

a、种子液的制备：从斜面培养基上刮取一接菌环枯草芽孢杆菌的菌种接种到液体培养基中，摇床培养11h，转速为220r/min，温度为28℃，获得枯草芽孢杆菌的种子液；

液体培养基(g/L)：胰蛋白胨12、酵母提取物6、氯化钠11，水补足至1L；

b、发酵液的制备：将步骤(a)获得的种子液以10％(v/v)的接种量接种到发酵罐中，再转速为100～120转/min，温度为28℃，200L发酵罐，通气量为5m³/h的条件下进行发酵，发酵时间为16～18h，既得枯草芽孢杆菌发酵液；

发酵培养基(g/L)：玉米粉11.5、葡萄糖6、豆饼粉19.8、CaCO₃ 7.5、硫酸铵1.5、K₂HPO₄0.5、七水硫酸镁0.3、一水硫酸锰0.3，水补足至1L；

(2)黑曲霉菌发酵物的制备：黑曲霉菌→菌种斜面→三角瓶培养→种子罐培养→发酵罐培养→清洁发酵室→备料→投料混合→保温培养，具体地步骤如下：

a、菌种斜面

将冻干的黑曲霉菌菌种在无菌环境中转接到事先准备好的试管斜面上，将温度控制在26～28℃，培养38～42h；

b、三角瓶培养

培养基制备：去皮的马铃薯100g，切成小块，加水500ml煮沸15min滤去马铃薯块，将滤液补足至500ml，加葡萄糖10g，溶化后分装三角瓶，置于灭菌锅内，在0.11MPa压力下灭菌30min，冷却后制成斜面备用；

菌种活化和扩大培养：在无菌条件下从原菌菌种斜面上挑选少许菌苔，置放三角瓶斜面内进行“之”字画线，然后置于24～25℃温箱内培养25h，经检查无杂菌，菌体生长整，再置于27～29℃温箱内培养50～70h，肉眼观察，菌苔丰满，涂片，染色检查无杂菌，分生孢子大小一致的，放置于冰箱中存放备用；

c、种子罐培养：

培养基配方：蔗糖3％，玉米秸秆浸出汁3％，蛋白胨3％，硫酸铵0.7％，磷酸二氢钾0.4％，硫酸镁0.4％，pH值5.0～5.2；所述百分比为质量体积百分比，溶剂为蒸馏水；

空种子罐灭菌：发酵罐在应用前清洗干净，排除污物，并在0.11MPa压力下灭菌30min；

种子罐装料：参照培养基配方按比例装料，投料量不得超过罐容积的70％；

种子罐灭菌：装好料后，在0.11MPa压力下，温度达到121℃，灭菌30min，冷却至25℃即可接种；

种子罐接种：在无菌条件下将每个三角瓶斜面菌种加100ml无菌水，把菌苔刮下制成孢子悬浮液，含菌量为10×150CFU/ml；将制备好的孢子悬浮液，在无菌条件下接种后，按质量比1％的比例接种于冷却至25℃的种子罐内进行培养；

种子罐培养条件控制：接种后在温度为26～28℃，压力在0.05MPa，通气量1：0.9和搅拌速度120r/min条件下，培养18～24h，所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min；

种子罐培养条件检测：接种后4h开始，每隔2h取样一次检测，检测内容包括菌体生长情况，含菌量，pH值，达到指标即可移到发酵罐内发酵；

合格指标：菌体生长整齐，菌丝成簇或多数为菌丝团；

d、发酵罐培养

发酵罐空消：发酵罐在接种前严格灭菌处理，洗净后在0.11MPa压力下灭菌30min；

发酵罐投料：配比同种子发酵液，投料量不超过罐容积的70％；

发酵罐灭菌：装好料后，在0.11MPa压力下，温度达到121℃，灭菌30min，冷却至25℃即可接种；

发酵罐培养：搅拌速度100～120r/min，罐压0.05MPa，移种4h内通气量为1：(0.4～0.5)；以后逐渐增大至1：0.8，一般发酵周期为72～96h，在厚垣孢子大量形成时，符合放罐指标，即可放罐；所述通气量为每min进出空气体积比V/V/min；

发酵罐检测：投料后6h开始，每隔4h取样一次检测，至48h后，间隔期缩短为2h；

放罐标准：厚垣孢子含量≥4×150CFU/ml；杂菌量≤0.3％；

e、清洁发酵室

将发酵室地面及空间清理干净，拌料场内拌料机、链条、皮带输送机清洗干净，晾干；拌料场周围打扫干净，工器具清洗晾干；将场地、设备用漂白粉上清剂喷洒消毒，静置30min；

f、备料

将种液运入拌料场，按粉碎后的玉米芯：种液＝10：3的比例运入粉碎后的玉米芯；

g、投料混合

根据拌料机的生产能力，按照生产工艺要求和配料比，把菌种和粉碎后的玉米芯加入到拌料机，搅拌5min；把混匀的原料放于皮带传送机，进入同时开启的链条粉碎机粉碎，粉碎均匀的湿料经皮带传送机进入装袋程序，扎口；

h、保温培养

预先将发酵室及地面温度保持在25℃以上；将料袋单排码放，平躺于地面，隔4h，倒垛，料袋揉搓，保证发酵均匀。

(3)纤维素链霉菌发酵物的制备

a、种子液的制备：从斜面培养基上刮取一接菌环纤维素链霉菌的菌种接种到液体培养基中，摇床培养11h，转速为220r/min，温度为28℃，获得纤维素链霉菌的种子液；

液体培养基(g/L)：硝酸钾2、磷酸氢二钾1、七水硫酸镁1、氯化钠1、七水硫酸亚铁0.02，水补足至1L；

b、发酵液的制备：将步骤(a)获得的种子液以10％(v/v)的接种量接种到发酵罐中，再转速为100～120转/min，温度为28℃，200L发酵罐，通气量为5m³/h的条件下进行发酵，发酵时间为28～30h，既得纤维素链霉菌发酵液；

发酵培养基(g/L)：高氏1号培养基添加3％的玉米秸秆浸出汁；

c、固体发酵：用玉米秸秆粉吸附步骤b制备的纤维素链霉菌发酵液，初始水分控制在50～60％，通风发酵，发酵12～48h，料温升至50℃，48h后温度开始降低，纤维素链霉菌开始生长，7～10天后形成放线菌孢子；发酵结束后，纤维素链霉菌发酵物中纤维素链霉菌活菌数达到40亿个/g，纤维素酶活大于4000U/g；

(4)按比例混合：根据混合管的容积，以草炭为载体，加入步骤(1)～(3)分别制备的枯草芽孢杆菌发酵液、黑曲霉菌发酵物、纤维素链霉菌发酵物以及粉碎后的玉米芯，加入蒸馏水，调节水分至50～70％，发酵15～20天，混合后搅拌，获得初步发酵产物，使枯草芽孢杆菌5～10亿个/g、黑曲霉菌5～10亿个/g和纤维素链霉菌5～10亿个/g；

(5)将步骤(4)获得的初步发酵产物，在50～70℃下干燥至水分为10～12％，粉碎后，分级过筛，机械包装，成品入库制得玉米秸秆腐熟剂。