[发明专利]一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用

说明书

本发明提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC，其DNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明还提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，该融合蛋白融合有上述外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签。同时，本发明还提供一种含有上述外切型硫酸软骨素酶ABC的重组载体和转化体。本发明提供的外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列对大肠杆菌的偏好性达0.97，从而提高了硫酸软骨素酶ABC的DNA序列在大肠杆菌中的表达效率，进而直接降低了外切型硫酸软骨素酶ABC的生产成本。另外，本发明还提供一种上述外切型硫酸软骨素酶ABC的制备方法和应用。

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体地，涉及一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用。

背景技术

硫酸软骨素酶(chondroitinase或chondroitin sulfateyase，简称为“ChSase”)是一类能将硫酸软骨素、软骨素、透明质酸等糖胺聚糖降解为不饱和二糖(ΔDi及寡糖)的裂解酶。根据其作用底物的差异主要分为ChSase ABC、ChSase AC、ChSase B及ChSase C等类型。

目前，ChSase ABC为特异性最为广泛的一类硫酸软骨素裂解酶。近几年，国际上对ChSase ABC的关注越来越多，相关学术论文的数量迅速增长。而且研究表明ChSase ABC有多种重要用途，在基础研究中它用来构建二糖和寡糖的基因文库；研究糖胺多糖结构和性质；在临床领域，用来治疗一些疾病。另外有两项新增应用非常重要：一是作为（chondroitin sulfate, 简称为“CS”）的检测试剂，2010版药典规定CS原料药进行含量测定时需要进行如下操作：用ChSase ABC酶解待检测CS，测定双糖总含量。二是在酶法生产低分子量CS中作为催化剂应用。大量研究发现，当将CS的分子量降低至2～10kD时，其药效更为明显，对防止动脉粥样硬化、风湿性炎症和伤口愈合有更好的疗效。目前对低分子量CS的制备常采用酸水解法、离子交换法和酶解法。比较而言，酶解法需要的条件不高且容易控制，因而具备较大的优势。酶解法的关键在于获得大量、廉价的硫酸软骨素裂解酶。

因此，ChSase ABC具有生物学作用，应用前景广阔。然而，目前国内没有产品供应，全部依靠进口，而且由于当前酶的提取效率、重组表达效率及亲和纯化能力普遍较低，使其在国际市场的价格居高不下。较低的生产能力和过高的价格是制约其功能研究和应用开发的重要因素。所以，开发ChSase ABC的新型高效表达和纯化技术具有极其重要的研究价值，其成功研制对提升我国ChSase ABC生物表达的技术水平及拓展其应用领域具有重要的科学意义。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种外切型硫酸软骨素酶ABC及其制备方法与应用，以解决上述问题。

具体地，本发明采取如下技术方案：

一种外切型硫酸软骨素酶ABC，它的DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

一种外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，它融合有外切型硫酸软骨素酶ABC和纯化标签，其中，所述外切型硫酸软骨素酶ABC的DNA序列如SEQ ID NO.1所示，所述纯化标签为His标签、MBP标签或GST标签。

基于上述，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的分子量为114～154.8 kDa。

基于上述，以硫酸软骨素A及硫酸软骨素C的混合物为底物时，所述外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白的酶活为1553～5968IU/L发酵液。

一种重组载体，它包括载体和与所述载体连接的上述的外切型硫酸软骨素酶ABC融合蛋白，其中，所述载体为pET-28a、PMAL-C2X或pGEX-4T1。

一种转化体，它是将上述的重组载体转化到宿主细胞中进行表达而得到的，其中，所述宿主细胞为大肠杆菌BL21、大肠杆菌BL21(DE3)或大肠杆菌Trans109。