[发明专利]一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000完成DNA组装的试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000完成DNA组装的试剂盒，是由T5核酸外切酶和含PEG8000的缓冲体系组成；以总体系为20uL计，T5核酸外切酶的用量是0.02U‑0.16U/总反应体系，PEG8000的缓冲体系组分为110±5mM、pH＝7.5的Tris‑HCl，10±1mM MgCl₂，10±1mM DTT和质量比5±1％的PEG8000。本发明还公开了所述试剂盒在DNA重组无缝克隆中的应用，实验证实本发明的试剂盒和相关的DNA组装方法与已经商业化的组装试剂具有等同的精确、高效和便捷的特点，但却比目前商业化试剂盒的售价低100倍，较现有方法更为经济和实用。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种DNA组装的试剂盒其应用，尤其涉及一种依赖T5核酸外切酶和PEG8000完成DNA组装的廉价试剂盒及其应用。

背景技术

DNA克隆是在40年前发明的技术，通过酶切和连接来完成DNA分子的融合，对分子生物学的发展具有里程碑的意义，其仍是当前最广为人知的方法。但伴随着代谢工程和合成生物学的出现和发展，遗传模块的构建和修饰对克隆方法的要求也越来越高。酶切和连接方法的低效、序列依赖和非模式化使得它已经不适合当前的操作，最近这些年，出现了多种DNA组装的新技术，克服了传统的酶切和连接方法的限制。

根据这些方法的运行机制，可以将其分为限制性酶依赖型克隆、体外重组依赖性克隆、体内重组依赖性克隆和短片段拼接克隆。其中，体外重组克隆的方法又主要分为依赖聚合酶链式反应(PCR)方式完成的组装和依赖短同源臂重组完成组装。其中，依赖短同源重组的的方法完成的组装具有序列非依赖性和连接非依赖的特点，选择上更加自由。主要是在体外的两个分子末端设计上一段较短的序列完全相同的同源区(长度15bp-50bp不等)，借助不同的酶切割出单链末端，互补的单链末端自由退火，之后在其他酶系的辅助下在体外完成修复或者直接转化细胞，在体内酶系的帮助下完成DNA修复，进而完成DNA克隆的目的。目前常用的组装方法根据机理可以分成两大类：一种是借助于高保真DNA聚合酶的3’-5’核酸外切酶活性，在不加入dNTP的情况下，其3’-5’核酸外切酶活性可以将DNA切割出5’-单链末端，这种具有5’单链末端的DNA分子间自发退火，形成具有单链缺口的环形DNA，之后这种分子在胞内完成修复获得完整的质粒。另一种是著名的Gibson DNA组装的方法，其首先是借助于T5核酸外切酶将DNA分子切割出3’单链末端，之后3’单链末端自发退火形成分子间搭配，再在Phusion DNA聚合酶的作用下完成对缺失DNA的修复，之后在Taq DNA连接酶的作用下完成连接，进而在胞外完成DNA分子修复，形成完整的DNA分子，后有人在Gibson组装技术的基础上作出改进，发现Taq DNA连接酶及其辅因子NADH在做克隆时不是必须的，将其命名为Hot-Phusion技术。此外，本专利申请人也注意到近岸蛋白质科技公司申请了一份专利(申请公布号：CN 107760706A)；该专利提到了只利用T5核酸外切酶可以做组装，给出的T5核酸外切酶的有效浓度为0.01U-20U之间。使用的缓冲体系为10～100mM KAc，20～100mM Tris-Ac，1～20mM Mg(Ac)2和1～5mM DTT，反应温度为25℃或37℃，反应时间是10-15min，但实施的结果是整体效价偏低。

当前各种组装的方法层出不穷，各有优缺点和最适合的领域，但目前体外组装方法要么整体价格偏贵要么效率不够高，不适合大规模的推广使用。伴随着合成生物学领域的发展，对克隆技术提出了更高的要求，精确、高效、简便和经济的克隆方法更有利于合成生物学的发展。经检索，通过构建一种依赖少量的T5核酸外切酶在PEG8000的帮助下并优化条件完成DNA组装的方法TEDA(命名为TEDA组装，T5 Exonuclease Dependent Assembly)，和相关依赖T5核酸外切酶和PEG8000完成DNA组装的试剂盒还未见报道。

发明内容